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1、组蛋白去乙酰化酶3在小鼠心肌纤维化中的作用及机制研究向家培雷玉华*恩施土家族苗族自治州中心医院心血管内科,恩施445000*通讯作者：摘要目的探究组蛋白去乙酰化酶3(Histonedeacetylase3,HDAC3)在异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导的小鼠心肌纤维化中的作用及机制。方法采用ISo皮下多点注射的方式构建小鼠心肌纤维化模型，分别采用HDAC3特异性抑制剂RGFP966干预，二维心脏超声检测小鼠心脏功能参数，包括射血分数(EjeCIiOnfraCIion,EF)、短轴缩短率(fractionshortening,FS)、左室收缩末期内径(LeftVentric
2、ularend-Systolicdiameter.LVESD)和左室舒张末期内径(Lef【ventricularend-diasl。IiCdimension,LVEDD)；马松染色观察各组小鼠心肌纤维化状况；实时荧光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中胶原蛋白1、胶原蛋白3及结缔组织生长因子(ConneCtiVeIiSSUegrOWIhfaCtor,CTGF)的mRNA表达水平；最后，免疫印迹WeSlernblOl检测Klotho及促纤维化相关信号分子的蛋白表达水平。结果ISO刺激可明显上调小鼠心肌组织中HDAC3蛋白表达；RGFP966干预可明显改善ISO刺激所致的小鼠心功能不全，减轻小鼠心肌组
3、织中胶原沉积及纤维化标志物的mRNA表达；机制上，RGFP966可明显上调心肌纤维化小鼠心肌组织中抗纤维化蛋白Klotho的水平，同时阻断Smads信号通路的激活。结论心肌纤维化时,心肌组织HDAC3的蛋白表达水平明显增加，抑制HDAC3可通过上调Klotho改善心肌纤维化。关键词HDAC3,心肌纤维化异丙肾上腺素，KlothoTheRoleandMechanismofHistoneDeacetylase3inCardiacFibrosisinMiceAbstractObjectiveToexploretheroleandmechanismofHistonedeacetylase3(HDAC3
4、)inisoproterenol(ISO)-inducedcardiacfibrosisinmice.MethodsAmousecardiacfibrosismodelwasconstructedbysubcutaneousmulti-pointinjectionofISO.TheHDAC3specificinhibitorRGFP966wasusedtointervene.Two-dimensionalechocardiographywasusedtodetectthecrdiacfunctionparametersofmice,includingejectionfraction(EF)an
5、dfractionshortening(FS),Leftventricularend-systolicdiameter(LVESD)andLeftventricularend-diastolicdimension(LVEDD);Massonstainingwasusedtoobservecardiacfibrosis;real-timequantitativePCRwasusedtodetectthemRNAexpressionlevelsofcollagen1,collagen3,andconnectivetissuegrowthfactor(CTGF)inthecardiactissue;
6、finally,westernblotwasusedtodetecttheproteinexpressionlevelsofKlothoandfibrosis-relatedsignalmolecules.ResultsISOstimulationcansignificantlyIipregulatetheexpressionofHDAC3proteininheart;RGFP966cansignificantlyimprovethecardiacinsufficiencyofmiceinducedbyISO,andreducethemRNAexpressionofcollagendeposi
7、tionandfibrosismarkersinmousemyocardialtissue;,RGFP966cansignificantlyupregulatethelevelofanti-fibrosisproteinKlothointhecardiactissueofmicewithmyocardialfibrosis,thusblockingtheactivationoftheSmadssignalingpathway.ConclusionDuringcardiacfibrosis,theproteinexpressionlevelofHDAC3incardiactissueissign
8、ificantlyincreased.InhibitionofHDAC3canimprovecardiacfibrosisbyUpregulatingKlotho.KeywordsHDAC3,cardiacfibrosis,isoproterenol,Klotho前言心脏纤维化是多种心血管疾病的共同病理特征，包括高血压、心肌梗死、扩张性心肌病和糖尿病心肌病1。在心脏纤维化进程中，细胞外基质和胶原蛋白的大量产生和沉积可显著增加心室肌僵硬度并破坏心功能，特别是舒张功能，最终可导致心力衰竭的发生2。尽管目前，心肌纤维化的调控机制尚不完全明确，但许多研究都已经证实了TGF-WSmad信号通路在心肌纤维
9、化发生发展中的重要地位3卜细胞外的TGF-B可通过活化心脏成纤维细胞上的1型和II型TGF-B受体进而磷酸化胞浆内的Smad2和Smad3。一旦Smad2和Smad3被磷酸化，两者将与Smad4形成复合体进入细胞核，诱导促纤维化相关基因的转录激活4。因此，阻断TGF-Smad信号的活化是预防和治疗心肌纤维化的主要策略之一。组蛋白去乙酰化酶3(Histonedeacetylase3,HDAC3)是组蛋白去乙酰化酶家族的重要成员之一，可通过催化组蛋白去乙酰化，影响染色质结构稳定性并调控基因表达5。既往研究显示，HDAC3对哺乳动物生长发育至关重要；但HDAC3的异常表达也可导致多种疾病的发生6.最
10、近的研究显示，在肾脏纤维化时，肾小管上皮细胞中的HDAC3蛋白表达水平明显升高。而敲低HDAC3可明显抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化，进而抑制肾脏纤维化的进展7。但HDAC3在心肌纤维化中的作用目前尚未被报道，本研究通过构建异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导对的的小鼠心肌纤维化模型,观察HDAC3在小鼠心肌组织中的表达状况，并使用HDAC3特异性抑制剂RGFp966干预，探讨HDAC3影响心肌纤维化的作用及机制，旨在为今后心肌纤维化的预防及治疗提供参考依据。1 .材料与方法1.1 材料与试剂RGFP966（纯度:99.81%,货号：HY-13909）和ISO（纯度
11、:98.61%,货号：HY-B0468）均购自于上海MedChemEXPreSS公司L抗GAPDH（货号ab8245）、KlothO（货号:abl81373）、P-Smad3（货号：ab52903）、T-Smad3（货号：ab208182）.-SMA（货号:ab5831）、HDAC3（货号：ab32369）购自于美国AbCam公司；二抗:羊抗兔IgG（货号:926-32211）购自于美国LICOR公司。1.2 实验动物及心肌纤维化模型的建立本实验中所使用的实验动物为雄性C57BL/6J小鼠购自于湖北省实验动物研究中心、。小鼠周龄约1012周，体质量2363llg。根据随机数表法,将40只小鼠随
12、机分为对照组（Sham组）、RGFP966组、ISo组、ISO+RGFP966组，每组10只。ISO组和ISO+RGFP966组小鼠接受皮下注射ISo（lmgkg,bid）,连续14天。RGFp966及ISO+RGFP966组小鼠于ISo注射当天开始，每天下午接受皮下注射RGFP966（10mgkg,qd）,连续14天。本实验所有操作获实验动物护理和使用委员会批准。1.3 小鼠心脏功能的评价采用MyLab30CV多普勒超声诊断仪器对四组小鼠进行无创心功能检测。使用浓度为L5%的异氟烷对小鼠进行吸入麻醉。待小鼠麻醉成功后，剃去小鼠心前区毛发，充分暴露小鼠皮肤C超声探头频率为30MHz,分别记录穿
13、过左心室前壁和后壁的M型超声，获取小鼠心脏功能参数，包括射血分数（EjeClionfraClion,EF）、短轴缩短率（fractionShorlening,FS）、左室收缩末期内径（LeflVemriCUIarend-SySlOIiCdiameer,LVESD）和左室舒张末期内径（LeIiventricularend-diastolicdimension,LVEDD）o1.4 Westernblot剪取各组小鼠心室肌组织约30mg,充分研磨后在RIPA裂解缓冲液中进行超声裂解C提取各组小鼠心肌组织中的总蛋白C检测各样本蛋白浓度后使用上样缓冲液定容至等浓度，随后分装并置于-80C冰箱长期保存。
14、分别配制10%的分离胶和6%的浓度胶，对各组小鼠心肌蛋白进行SDS-PAGE电泳。待电泳结束后,将蛋白转入醋酸纤维素膜中,并在4C。下使用牛奶封闭40分钟。随后，分别用抗HDAC3xKlothoxP-Smad3、T-Smad3、-SMA和GAPDH的一抗于4C。下孵育过夜，随后于二抗稀释液中避光孵育，置于摇床上1小时。使用化学发光法对目的条带显影并定量C1.5 实时荧光定量PCR使用TRIZoI试剂盒提取各组小鼠心肌组织总RNA,紫外分光计测定纯度和浓度后，对各样本总RNA进行逆转录，获取cDNA。随后，使用ChamQTMSYBRqPCRMaSIerMiX试剂盒对各样本CDNA进行实时荧光定量
15、PCR检测，最终以如aciin作为内参，用才黑。法计算基因的相对表达水平。各基因引物序列如表1所示。表1各基因引物序列GeneSizePrimersequence(5,3,)CollagenI(ColI)198F：Atcgctagtcgtagtcgtagtcr：CgtagtcgtgtagtcgaaaacCollagenIII(ColIII)187F:CCAGCTGATAGTCGArGTCGlAGR：CagtcgatgiaagctagtcgtagConnectivetissuegrowthfactor(CTGF)192f：TgtcgatgcaaagciagccacagR:AACTArGTCGAT
16、GATGCTGATGCGT-aciin202F：CttagciagatgciagtcgiagtcgtR:CCAGTCGATGTCGArGIAGCAGTCGA1.6免疫组织化学染色将心肌组织石蜡切片经过脱蜡水洗、抗原修复、羊血清封闭、HDAC3抗体孵育、二抗孵育、DAB显色、脱水、透明及封片等一系列免疫组织化学染色步骤后，在光学显微镜下观察心肌组织中HDAC3表达状况，并拍照记录。使用ImageProPhIS6.0软件对心肌组织中HDAC3阳性区域进行定量。1.7 马松染色将心肌组织石蜡切片经过脱蜡水洗后，使用苏木素染液浸染5分钟，中性盐酸酒精溶液分化5秒，自来水流水冲洗10分钟。随后，使用丽春
17、红酸性品红溶液染色4分钟后，迅速用蒸储水漂洗3次。使用磷铝酸水溶液孵育3分钟，苯胺蓝染色5分钟，1%冰醋酸孵育1分钟。蒸镭水漂洗后，脱水、透明及封片并在光学显微镜下观察拍照。使用ImageProPlus6.0软件对心肌组织中胶原纤维进行定量。1.8 统计方法使用SPSS26.0软件对本研究中的数据进行分析,计量资料采用均数士标准差进行比较。两组之间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析(One-WayANOVA)。PvO.05被认为有统计学差异。2 .结果2.1 心肌纤维化时，心肌组织中HDAC3的蛋白表达状况如图IA所示，免疫印迹WeSIernbk）I结果显示，ISO组小鼠心肌组织中HD
18、AC3的蛋白表达水平明显高于Sham组（P0.05）；免疫组织化学染色进一步证实（图IB）,ISO组小鼠心肌组织中HDAC3阳性百分比明显高于Sham组（4L322.56vs.9.331.45）（P0.05）。图1心肌纤维化时，心肌组织中HDAC3的蛋白表达状况A:免疫印迹WeSIernblot结果；B:免疫组织化学染色结果；Sham组：对照组，ISO组：心肌纤维化组。ISO:isoproterenolo与Sham组比,*P0.05;2.2 各组小鼠心脏功能的比较如图2A-D所示,与Sham组相比，ISo组小鼠EF和FS明显降低（iP0.05）,LVEDD和LVESD明显增加（均P0.05）；
19、与ISO组小鼠相比，ISO+RGFP966组小鼠EF和FS明显增加（均P0.05）,LVEDD和LVESD明显降低（均P0.05）；本部分研究结果表明，HDAC3抑制可明显改善心肌纤维化小鼠的心脏收缩和舒张功能.图2各组小鼠心脏功能的比较A：射血分数比较；B:短轴缩短率比较；C:左室舒张末期内径；D:左室收缩末期内径。Sham组：对照组，ISO组：心肌纤维化组。EF:ejectionfraction;FS:fractionshortening;LVEDD:leftventricularend-diastolicdimension.LVESD:leftventricularend-systoli
20、cdimension;ISO:isoproterenol;与Sham组比,*P0.05;与ISo组比,#P0.05.2.3 各组小鼠心肌纤维化的比较马松染色结果显示（图3A）,与Sham组相比，ISO组小鼠心肌组织中胶原沉积明显增加（P0.05）；相反，经RGFP966干预后，心肌纤维化小鼠心肌组织中胶原沉积明显减少（P0.05）o实时荧光定量PCR进一步显示（图3BD）,RGFP966干预可明显抑制ISo导致的心肌组织促纤维化基因包括Collagen1、CollagenIII和CTGF的mRNA表达增加（均PA*ZKE - SWW=OO图3各组小鼠心肌纤维化的比较A：马松染色；B-D:实时荧
21、光定量PCR检测Collagen1、CollagenIII和CTGF的mRNA表达。Sham组：对照组，ISO组：心肌纤维化组CISO:isoproterenol;与Sham组比,*P0.05;与ISo组比,#PVo.05.2.4 RGFP966减轻小鼠心肌纤维化的机制探讨既往研究表明Klotho可通过抑制TGF-受体阻断促纤维化的TGF-Smad信号通路，发挥抗纤维化作用。且HDAC3敲低可抑制肾小管上皮细胞中Klolho的表达。因此，这里我们检测了四组小鼠心肌组织中HDAC3及TGF-B受体下游的信号分子Smad及-SMA的蛋白表达。如图4所示，与Sham组相比，ISo组小鼠心肌组织中Kk
22、）Iho蛋白明显降低（P0.05）,磷酸化的Smad3（P-Smad3）及Ct-SMA的蛋白明显增加（均PVI05）；相反，RGFP966干预可明显上调心肌纤维化小鼠心肌组织中Klotho的蛋白水平（P- Hd CPeES.17tpeESdBump PloU.)a- 11有10& Had9vwso图4RGFP966减轻小鼠心肌纤维化的分子机制Sham组：对照组，ISO组：心肌纤维化组。ISO:isoproterenol;P-Smad3：磷酸化的Smad3;T-Smad3:总的Smad3；与Sham组比,*P0.05;与ISo组比,#PVo.05.3 .讨论本研究首次揭示在ISO诱导的小鼠心肌纤
23、维化中，心肌组织中HDAC3的蛋白表达明显增加C同时，本研究观察了HDAC3特异性抑制剂RGFP966抑制ISo心肌纤维化的作用，并进一步探讨了RGFP966抗心肌纤维化的可能机制C既往研究显示，心肌纤维化时，心脏成纤维细胞产生大量的胶原纤维，沉积于心肌细胞外基质8。此外，心脏成纤维细胞在促纤维化因素（如ISO,TGF-及高糖）的刺激下，也可转分化为表达-SMA的肌成纤维细胞，也是导致细胞外基质的总要原因之一9-10TGF-B是目前研究最为深入的促纤维化因子，其存在有3种不同的亚型，分别为TGF-pl、TGF-2及TGF-3TGF-B可通多种机制诱导心肌纤维化。除了增加胞外基质的沉积并抑制其降
24、解，TGF-B还参与了多种促纤维化细胞因子的表达110目前，已经公认的心肌纤维化模型主要包括以下6种，1自发性高血压大鼠；2.糖尿病心肌病；3胸主动脉缩窄；4心肌梗死；5二肾一夹及肾下主动脉缩窄；6.1So皮下注射“2。我们知道，动物模型的高仿性，稳定性和易操作性是心血管疾病研究的首要考虑因素。相比于前5种模型，1SO模型的建立动物死亡率低，且操作方法更为简便（不用开腹开胸，皮下多点注射即可），造模周期也相对较短，且更加接近于疾病进程。机制上，ISO刺激可导致小鼠心肌组织中TGF-B的表达增加，促进心肌纤维化的发生13-14。因此，本研究选择了ISO诱导的小鼠心肌纤维化模型，观察到HDAC3在
25、ISO注射14天后表达水平明显增加，这就提示HDAC3可能参与了小鼠心肌纤维化发生发展的进程在哺乳动物中，组蛋白的乙酰化受到组蛋白乙酰转移酶（HiSloneaCetyltranSferases,HATs）和HDACs的动态调控。一般而言，HDACs通过去乙酰化赖氨酸残基和恢复染色质组蛋白的正电荷导致染色质凝聚，阻碍转录因子的进入，最终抑制基因表达115。在肾脏纤维化形成过程中，HDACS的上调可影响促纤维化生长因子、细胞信号分子、细胞外基质蛋白和肾脏抗纤维化蛋白的表达C例如，HDACs抑制剂可明显上调抗纤维化蛋白Klotho及BMP-7的水平，最终抑制肾脏纤维化的进展16。最近的一项研究表明，
26、肾小管上皮细胞HDAC3特异性敲除或使用HDAC3特异性抑制剂RGFP966均可减轻输尿管结扎引起的肾脏纤维化，其机制可能与HDAC3对抗纤维化蛋白KIotho的抑制有关7。本研究中，我们发现RGFP966可明显上调心肌纤维化小鼠心脏组织中Klotho的蛋白表达，同时减轻小鼠心肌纤维化。我们推测，RGFP966可能通过Klotho介导的TGF-Smad信号通路阻断发挥抗纤维化作用总之，本研究首次证实了HDAC3抑制可改善ISo诱导的小鼠心肌纤维化。HDAC3可能通过抑制抗纤维化蛋白Klotho,进而放大TGF-WSmad信号，最终导致小鼠心肌纤维化的发生。但仍需要更深入的实验进一步探讨HDAC
27、3调控Klotho的精确的分子靶点。参考文献1. MeagherPatrickB,LeeXavierAlexander,LeeJosephetal.CardiacFibrosis:KeyRoleofIntegrinsinCardiaCHomeostasisandRemodeling.J.Cells,2021,10:undefined.2. SpoladoreRoberto,FalasconiGiuIio5FioreGiorgioetal.Cardiacfibrosis:emergingagentsinpreclinicalandclinicaldevelopmental.ExpertOpinI
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