辅酶ⅠNADH含量试剂盒说明书.docx

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1、辅前INAD(三)含试剂盒说明书微法100管/48样注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义:辅酶INAD(三)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖醇解(EMP)和三粉酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(三)含量和NADHNAD比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(三)及NADHNAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH

2、/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。渊定原理:分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型曝嚏蓝(MTT)为甲瓒,在57Onm卜.检测吸光值;而NAD+可被乙静脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。需自备的仪器和用品:酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸谣水。试剂的组成和配制:酸性提取液:液体50mLxl瓶,4C保存;碱性提取液:液体50mLxl瓶,4C保存;试剂一:液体IOmLXl瓶,4C保存;试剂二:液体3mLl瓶,4C保存;试剂三:

3、粉剂Xl瓶,-20aC保存,用时加入3mL蒸馆水,混匀,用不完的试剂4保存一周;试剂四:粉剂Xl瓶,4C保存,用时加入3mL蒸储水,混匀,用不完的试剂4C保存一周;试剂五:液体3.6mLxl瓶,4tC保存:试剂六:液体30mLxl瓶,4aC保存;试剂七:液体50mLxl瓶,4aC保存。NAD+和NADH的提取:1血清(浆)中NAD+和NADH的提取:NAD的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为1:510的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入ImL酸性提取液),95水浴5min(盖紧,以防止水分散失):冰浴中冷却后,100OOg4C离心IOmin;取500L上清液,加入

4、500L碱性提取液使之中和,混匀,100OOg4匕离心Iomin,取上清,置冰上待测。NADH的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为1:510的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入ImL碱性提取液),95C水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,100OOg4C离心IOmin;取500L上清液,加入500L酸性提取液使之中和,混匀,10000g4*C离心Iomin,取上清,置冰上待测。2组织中NAD+和NADH的提取:NAD的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为1:5-10的比例(建议取约OJg组织,加入ImL酸性提取液),冰浴研磨,95C水

5、浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g4离心IOmin;取500L上清液,加入500L碱性提取液使之中和,混匀,100Oog4C离心Iomin,取上清,置冰上待测。NADH的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为1:510的比例(建议取约0.1g组织,加入ImL碱性提取液),冰浴研磨,95C水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,100Oog4匕离心IOmin;取500L上清液,加入500L酸性提取液使之中和,混匀,10000g4匕离心IOmin,取上清,置冰上待测。3细胞或细菌中NAD+和NADH的提取:NAD的提取:先收集细胞或细菌到离心管内

6、,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为5001000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入ImL酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,IoooOg4C离心IOmin;取500L上清液,加入500L碱性提取液使之中和,混匀,10000g4*C离心Iomin,取上清,置冰上待测。NADH的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(IO4个):碱性提取液体积(mL)为5001000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入ImL碱性提取液),超声波破

7、碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95C水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,IoOOOg4离心IOmin;取500L上清液,加入500L酸性提取液使之中和,混匀,10000g4tC离心IOmin,取上清,置冰上待测。浦定步Ilh1、分光光度计或衡标仪预热30min以上,调节波长至570nm,蒸储水调零。2、加样表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样):试剂名称(L)对照管测定管样本2020试剂一8080试剂二3030试剂三3030试剂四3030试剂五3030试剂六200混匀,室温避光静置20min试剂六200充分混匀,静置5min后,200

8、00g,25C离心5min,弃上清,沉淀中加入:试剂七400400混匀,取200L转移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm卜.读取对照吸光值Al和测定管吸光值A2,计算4A=A2-A10注意事项:1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。3、反应过程中注意避光。4、若NAD+测定中(A2-A1)O.O3O2,NADH测定中AA(A2-A1)0.0222,说明样本中辅酶含量较低,己低于检测限,可做如卜.调整:(1

9、)将测定管避光静置时间20min延长到60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取0.2g样本或0.2mL样本加入ImL提取液。5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒100管保证测48个NAD-或NADH.NAD+和NADH含的计售:(一)NAD+含量的计算标准条件下的回归曲线为y=0.1475x+0.0302,R2=0.9978;其中y为AA,X为NAD+浓度nmol/mL1、血清(浆)中NAD+含量计算NAD+含量(nmol/mL)=(A-0.0302)0.1475Vl)(V3V1V2)=135.6(A-0.0302)2、组织、细菌或细胞中NAD+含量计算(D按样本蛋白浓度计算NA

10、D+(nmol/mgprot)=(A-0.0302)0.1475Vl)(VlCpr)=6.8(A-0.0302)Cpr(2)按样本鲜重计算NAD+(nmolg鲜重)=(A-0.0302)0.1475V1)(WV1V2)=13.6(A-0.0302)W(3)按细菌或细胞密度计算NAD+(nmol/IO4cell)=(A-0.0302)0.1475VI)(500V1V2)=0.027(A-0.0302)(二)NADH含量的计算标准条件下的回归曲线为y=0.1404x+0.0222,R2=0.9976;其中y为AA,X为NADH浓度nmol/mL1、血清(浆)中NADH含量计算NADH含量(nmol

11、/mL)=(A-0.0222)0.1404Vl)(V3V1V2)=142.5(A-0.0222)2、组织、细菌或细胞中NADH含量计算(D按样本蛋白浓度计算NADH(nmol/mgprot)=(A-0.0222)0.1404Vl)(VlCpr)=7.1(A-0.0222)Cpr(2)按样本鲜重计算NADH(nmolg鲜重)=(A-0.0222)0.1404V1)(WV1V2)=14.2(A-0.0222)W(3)按细菌或细胞密度计算NADH(nmol/IO4cell)=(A-0.0222)O.14O4V1)(500V1V2)=0.028(A-0.0222)VI:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL:V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。注意:最低检测限为O.lnmol/mL或0.1nmolg鲜重或0.00InmOImgprol咽优利科(上海)生命科学有限

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