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1、纤维素降解菌的筛选及特性研究摘要生物堆肥是大部分养殖场固废资源化利用的主要手段，具有投资小、效益高、有机固体废弃物重复资源化利用效率高等优点，但堆肥过程中也存在一些缺陷，如发酵周期长、有臭味、纤维素木质素分解不彻底等。牛粪中含有大量未能消化的纤维素和半纤维素，它们是影响堆肥腐熟进程、决定其堆肥产品质量的关键因素。因此，在牛粪堆肥发酵中选择添加合适的堆肥发酵菌剂和高效纤维素降解菌剂，是解决畜禽粪便堆肥周期长，降解率低等问题的有效途径。本研究采用富集培养及纯培养法从牛粪中将纤维素降解细菌进行分离并分析其降解特性，以期获得一些高效纤维素降解菌。采用水解圈法和3,5-二硝基水杨酸（DNS）法进行菌株筛
2、选与酶学特性研究，结合形态学方法对其初步鉴定，分子生物学方法对其鉴定其种属，共得到降解效果良好的菌株3株，分别命名为DH01、DHO2、DC02,其中DHOl为枯草芽抱杆菌，其纤维素酶活性最高；DH02为苏云金芽泡杆菌，纤维素酶活性次之；DCO2为贝莱斯芽抱杆菌，纤维素酶活性低于前两者。三种菌株均能不同程度分解纤维素，因此，可为牛粪堆肥发酵提供菌种思路，具有重要应用价值。关键词：纤维素降解菌，纤维素酶，分离，酶学特性AbstractBiologicalcompostingisthemainmethodfortheutilizationofsolidwasteresourcesinmostfar
3、ms.Ithastheadvantagesoflowinvestment,highefficiency,andhighefficiencyinthereuseoforganicsolidwaste.However,therearealsosomeshortcomingsinthecompostingprocess,suchaslongfermentationcyclesandOdor,incompletedecompositionofcelluloseandlignin,etc.Cowmanurecontainsalargeamountofundigestedcelluloseandhemic
4、ellulose,whicharethekeyfactorsthataffectthematurityofcompostanddeterminethequalityofthecompostproduct.Therefore,selectingandaddingappropriatecompostingfermentationinoculantsandhigh-efficiencycellulosedegradinginoculantsinthecattlemanurecompostingfermentationisaneffectivewaytosolvetheproblemsoflongco
5、mpostingcycleoflivestockandpoultrymanureandlowdegradationrate.Inthisstudy,enrichmentcultureandpureculturemethodswereusedtoisolatecellulose-degradingbacteriafromcowmanureandanalyzetheirdegradationcharacteristics,inordertoobtainsomehigh-efficiencycellulose-degradingbacteria.Usinghydrolysiscirclemethod
6、and3,5-dinitrosalicylicacid(DNS)methodforstrainscreeningandenzymaticcharacteristicsresearch,combinedwithmorphologicalmethodsforpreliminaryidentification,molecularbiologicalmethodstoidentifyitsspecies,atotalofThreestrainswithgooddegradationeffectswerenamedDHOl,DH02,andDC02.Amongthem,DHOlisBacillussub
7、tiliswiththehighestcellulaseactivity;DH02isBacillusthuringiensis,followedbycellulaseactivity;DC02isBacillusvelezsBacillus,cellulaseactivityislowerthantheformertwo.Thethreestrainscandecomposecellulosetodifferentdegrees,sotheycanprovidestrainideasforcattlemanurecompostingandfermentation,whichhasimport
8、antapplicationvalue.Keywords:cellulolyticbacteria,Cellulase,isolation,enzymaticproperties目录1 .引言12 .材料与方法22.1 试验材料22. 1.1样品来源23. 1.2培养基24. 1.3供试溶液25. 1.4供试仪器22.2 试验方法32. 2.1纤维素降解菌的富集33. 2.2纤维素降解菌的初筛34. 2.3纤维素降解菌的复筛及酶活测定错误!未定义书签。5. 2.4纤维素降解菌的滤纸条崩解实验36. 2.5纤维素降解菌的生物学鉴定43.数据与分析43.1 纤维素降解菌的富集、分离与纯化43.2
9、纤维素降解菌的初筛53.3 滤纸崩解实验53.4 维素降解菌的鉴定53 .4.1菌株形态学鉴定64 .4.2纤维素降解菌的分子生物学鉴定63.5纤维素降解菌的酶活测定73. 5.1标准曲线的制作74. 5.2酶活的测定84.结论与展望94.1 结论91 .1.1实验结果94 .1.2讨论94.2 展望9参考文献12谢辞错误!未定义书签。1 .弓I言纤维素是植物细胞壁的重要结构成分，容易与其结合的物质有许多，比如木质素以及果胶等，其结合方式和程度也决定着其资源化利用的能力。纤维素虽然是一种较为廉价的多糖物质，但其广泛地分布于地球上。作为有机物，它们大多都没有得到有效的利用，而是被直接丢弃或者烧毁
10、。现状表明这种做法严重浪费了宝贵的物质资源，从长远发展的角度来看，是不可取的，应尽快提出合理高效利用纤维素的解决方案，对其进行充分利用。纤维素存在于各种有机固体废弃物中，如秸秆、谷壳、废渣和畜禽粪便等。经分析可知，作为直链的纤维素多糖链并不存在分支，但存在糖残基，在糖残基里存在不少羟基,这些羟基会呈一定规律排列，当糖残基和羟基发生反应时，就会有氢键形成，这些氢键能够令多糖链结合得更加紧密，其结构也会更稳固。分析纤维素结构可知，其内部主要可以划分为两个区域，一个是结晶区；一个是无定形区，和前者相比，后者不但疏松度高，而且并不具备较大的分子密度，所以并无结晶结构存在。虽然纤维素可以分为这两个区域,
11、但是两者之间是渐变过渡，而非泾渭分明，其中结晶完善度和两方面存在关联，这两方面首先是纤维部位；其次是纤维素。经分析发现，在无定形区中，其多糖链更容易和各类物质比如化学试剂等接触，所以相较而言，该区域的降解难度更小。通常在植物纤维里，有百分之七十都是微晶纤维素，其余则是无定形纤维素。在这种情况下，纤维素存在较大的降解难度。目前对纤维素的处理方法主要有物理、化学处理法和生物降解法（文少白等，2010）,需要注意的是，物化处理法存在一些缺点，比如需要花费较高成本，反应条件也较为剧烈等等（陈洪章等，2005）o而生物降解法则是添加纤维素高效降解菌到畜禽粪便中进行堆肥发酵，这种方法因经济和有效，已成为当
12、前的研究热点（侯会利等，2015;BaklrianetaL,2008）o翻阅科研人员在纤维素降解方面的研究成果能够发现，当前有数千种微生物能够对纤维素进行降解，其主要包括三类，首先是细菌，这类细菌一般都为单细胞，和另外两类微生物相比，其体积是最小的，代谢期间，其存在较高的物质交换速率；其次是真菌，这是对纤维素进行降解的主力军，当前许多学者都对真菌选育问题展开了细致研究，其研究对象涉及米曲酶、黑曲酶等；最后是放线菌，此类微生物与真菌相比放线菌具有一些优势如耐各种高温、酸碱度等，因此，在高温条件下，微生物降解纤维素起着主要作用的就是放线菌。随着畜禽养殖业迅速发展，在产生巨大经济效益和社会效益的同时
13、，也会生成许多粪便，产生环保问题，因此当前亟需合适的手段来对粪便进行妥善处理。根据2015年的中央一号文件“加强农业面源污染治理，开展畜禽粪便资源化利用”的污染治理原则，应尽可能的对畜禽粪便进行减量化、无害化、资源化的综合治理，在减轻污染程度的前提下最大程度的实现畜禽粪便的资源化利用（李季，201l）o针对当前情况，本研究从宁夏某牧业养殖场采集牛粪，分离出三株具有纤维素降解功能的芽抱杆菌，对其进行形态学观察，16SrDNA基因序列分析，并对其进行水解圈测定、滤纸条崩解试验，进一步筛选可高效降解纤维素的菌株，以期为缩短牛粪发酵腐熟周期、开发牛粪堆肥菌剂及提高堆肥效率提供优良菌株来源。2 .材料与
14、方法2.1 试验材料2. 1.1样品来源实验样品来自宁夏某农牧业养殖场，采集后放置于4冰箱保存。3. 1.2培养基富集培养基：胰蛋白陈IOg,氯化钠10g,酵母浸膏粉5g,蒸储水IOoOmL,121,IOlkPa条件下灭菌30分钟。分离培养基：牛肉膏3.0g,蛋白陈10g,氯化钠5g,琼脂20g,121,IOlkPa条件下灭菌30分钟。筛选培养基：陵甲基纤维素钠(CMC-Na)20g,KH2PO41.5g,Na2HP042.5g,蛋白陈2.5g,酵母浸膏粉0.5g,琼脂20g,PH调至7,蒸僧水100OmL,121,IOlkPa条件下灭菌30分钟。发酵培养基:用于测定酶活。效皮50g,蛋白陈3
15、g,氯化钠5g,(NH4)2SO43g,KH2PO4Ig,MgSo47H2O0.3g,用NaOH饱和溶液调至PH为7.0,IOlkPa灭菌30mino滤纸条崩解培养基：(NHS43g,KH2PO4Ig,MgSO47H2O0.4g,酵母浸膏粉0.1g,pH7.0,IOlkPa灭菌30mi11o革兰氏碘液：用于纤维素水解圈的测定。KI2.0g,hl.0g,H2300mloDNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)按照农业部标准DNS试剂配制，柠檬酸缓冲溶液、葡萄糖标准溶液按照QB2583-2003标准配置。4. 1.3供试溶液葡萄糖、磷酸缓冲液、DNS显色剂、NaOH微晶纤维素、CMC-Na5. 1.4供
16、试仪器表2-1纤维素降解菌筛选及酶活测定涉及的主要仪器Table2-1Themainequipmentinvolvedinthescreeningofcellulosedegradingbacteriaandthedeterminationofenzymeactivity名称型号厂家洁净工作台HJ-CJ-2D上海苏净实业有限公司续表2-1名称型号厂家电热鼓风干燥箱DHG-9203A上海实研电炉有限公司恒温培养箱DHP-9162上海一恒科学仪器有限公司电子恒温水浴锅PK-824上海精宏实验仪器有限公司分析天平JB/T5374-199I梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司PH计pH808香港希玛仪器
17、有限公司紫外可见分光光度计752N上海仪电分析仪器有限公司2.2 试验方法2. 2.1纤维素降解菌的富集称取IOg牛粪样品放置于无菌三角瓶内，称取4保存的新鲜牛粪10.0g,将其装入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，振荡30min将其混匀。取ImL接入富集培养基进行富集12h03. 2.2纤维素降解菌的初筛此处准备牛肉膏蛋白陈培养基，然后选用粪便混合液作为溶液，对其进行稀释操作，得到三份两百微升的菌液，其稀释度分别为10-7倍、10.6倍、10-5倍，将其分别涂抹到前面的培养基中，接着将培养基放入培养箱培养一天，培养箱温度需设置为二十八摄氏度，一天后，在培养基中挑取单菌落，纯化3-4代斜
18、面接种后置于4C冰箱中保存备用；将纯化后的菌株点接于CMGNa培养基，28C倒置培养12h,加入革兰氏碘液浸染510分钟,观察有无明显水解圈，并用测量培养基中菌落的透明圈直径(D,cm)与菌落直径(d,cm),计算D/d二者的比值，根据比值大小初步确定分离菌株纤维素酶活力的高低。4. 2.3纤维素降解菌的复筛及酶活测定在液体发酵培养基中接种菌株(此处菌株需要具备较高的D/d比值)，28150rmin震荡培养24h,5000rmin离心Iomin,取上清液用于后续纤维素酶活的测定。纤维素酶活采用DNS法。酶活力单位(U)规定为:在特定条件下，1分钟内转化lmoL底物，或者底物中lmoL有关基团所
19、需的酶量。纤维素酶活性的测定:在25mL具塞比色管中加入用磷酸缓冲溶液配制的质量浓度1%的CMC-Na溶液ImL,加入待测酶液0.5mL,50具塞水浴30min,加入2.0mLDNS试剂，具塞佛水浴5min,立即冷却，蒸僧水定容至25mL,摇匀后在波长540nm处测定吸光度值，每管做5个重复取平均值，通过查葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量。绘制葡萄糖标准曲线:第一步，进行葡萄糖标准溶液(ImgmL)的配制。在配制这类溶液时，其原料为恒重的无水葡萄糖。第二步，准备1.2毫升、1毫升、0.8毫升、0.6毫升、0.4亳升、0.2亳升、。毫升标准溶液，分别往其中添加蒸储水，令其都变为两毫升。第三步，分别
20、加入两毫升DNS试剂，进行半小时沸水浴后，待其冷却。第四步，对其进行定容操作，令其变为二十五毫升，摇匀后，在其540nm波长处进行吸光度值的测定，各管3个重复求其均值，构建坐标轴，横纵坐标分别为葡萄糖含量、吸光度，绘制标准曲线并建立回归方程。2. 2.4纤维素降解菌的滤纸条崩解实验从液体发酵培养基中的培养液取出5mL,加入盛有100mL滤纸条崩解培养基的三角瓶中，每个三角瓶放入1/4直径9cm的扇形滤纸，在28、150rmin条件下摇瓶培养，以未加菌株的摇瓶作为对照，观察滤纸条崩解情况。3. 2.5纤维素降解菌的生物学鉴定将菌株接种于斜面送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，利用微生物
21、16SrDNA通用引物27F、1492R对菌株进行扩增。将测定的序列通过NCBI进行BLAST比对，选择同源性较高的菌株序列构建系统发育树，初步确定筛选菌株的种属。3.数据与分析3.1 纤维素降解菌的富集、分离与纯化第一步，准备液体培养基，其中的碳源只有一个，那就是纤维素。第二步，准备牛粪液，将其中的残渣去掉，往培养基中滴入一毫升牛粪液。第三步，将其放置在120rmin摇床中培养，其温度为三十摄氏度。培养一天后，观察培养基液体，会发现，其不但出现了气泡、白膜和沉淀物（渣状），还散发出臭味，液体也十分浑浊。究其缘由，则是因为牛粪液中存在微生物，其正在降解纤维素粉，并对能够对此物质进行降解的菌株进
22、行富集。第四步，准备纤维素固体培养基平板，然后选用三类菌液（10-7倍、10-6倍、10-5倍稀释度），将其分别涂抹到平板中。第五步，选择其中的单菌落，对其进行纯化操作。图3-1显示了获得的目标菌株的具体情况。（图3-1）图3-1分离出的6株活力较强的纤维素降解菌Figure3-1Sixisolatedstrainsofcellulosedegradingbacteriawithstrongvigor3.2 纤维素降解菌的初筛从新鲜牛粪中分离出4株具有纤维素分解能力的菌株，通过富集及在CMC-Na培养基上经革兰氏碘液染色筛选透明圈直径比值(Dd)较大的菌株分别命名为DHOl、DH02、DeO1
23、、DCo2、LH01、LH02o根据培养基上产生的降解圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小(见表2)筛选出能够降解纤维素效果较好的菌株。表3-1纤维素降解菌初筛结果Table3-1Resultsofpreliminaryscreeningofcellulosedegradingbacteria菌株编号菌落直径d/cm透明圈直径D/cmD/dDHOl0.311.845.94DH020.321.765.50DCOl0.421.774.21DC020.411.924.68LHOl0.551.813.29LH020.601.893.15由表31能够发现，选择恒温培养箱，对上述菌株进行培养，然后其就能
24、够在接触纤维素时发挥不错的降解作用，对其进行染色操作后，还会有降解圈形成。此处D/d比值于菌株纤维素酶活性成正比关系，如此就能够完成优势菌的初筛工作。但这并不能十分严格地确定菌株的产酶能力，因此还需要进一步进行深入筛选试验。3.3 滤纸崩解实验经分析可知，综合酶活力水平能够反映菌株接触纤维素时的降解能力情况，因此此处可以通过滤纸条崩解实验达到复筛目的。按照实验结果能够发现，在对各菌株培养三天后,将其分别放到带有纤维素的滤纸条上，DHOKDHo2、DC02分别将其降解为不定形状、近似糊状、糊状，而其他三类菌株并未获得良好的降解效果，只是令滤纸条边缘发生了一定变化。将其和对照组的情况进行比较能够发
25、现，上述六菌株都可以令滤纸崩解，只不过程度不同而已，此处需要保存菌株DCo2、DH02和DHOI用作接下来的实验。3.4 维素降解菌的鉴定3. 4.1菌株形态学鉴定将3株菌株于CMC-Na平板上三区划线，待长出单菌落后，观察菌落形态。经观察发现菌株DH02在平板上呈圆形，边缘不规则，菌落呈淡黄色，革兰氏染色结果为阳性；菌株DHOl在平板上呈圆形，表面粗糙，菌落呈微黄色，革兰氏染色结果为阳性；菌株DCO2在平板上呈圆形，菌落呈白色，革兰氏染色结果为阳性。图3-2菌株DHc)2、DHo1、DC02的革兰氏染色Figure3-2GramstainingofstrainsDH02DHOlandDC02
26、3.4.2纤维素降解菌的分子生物学鉴定提交到GenBank数据库的16SrDNA序列，得到DHo2、DHo1、DCO2的序列登录号分别为MZ144117、MZ144U6、MZl45243,菌株DHo2、DHOkDCO2的系统发育树为图3,根据比对得出DH02为苏云金芽抱杆菌、DHOl为枯草芽抱杆菌、De02为贝莱斯芽抱杆菌。KY974313.1BacillusIhuringiensisstrainSYIClQDH02NR-115526.1BocilluscerousstrainIAM12605NR-157733.1BeciUuspacificusstrainMCCC1A06129qINR_15
27、7731.1BacillusmobilisstrainMCCC1A05942NR-121761.1BacillustoyonensisstrainBCT-7112图3-3菌株DH02的系统发育树Figure3-3PhylogenetictreeofstrainDH02IMT974189.1BociUussubtiHsstrainH100IDHO1O OOlNR-O243.1BsciHusmojov&nsisstrainIFO15718ZRlI5063.1BgcHIuseooeransstrainDSMO2NR_115325.1GgcHIusnematocid。strainB-1KV444.1B
28、ociHusoloxonsi3strainNRRL-580图3-4菌株DHol的系统发育树0.001Figure3-4PhylogenetictreeofstrainDHOl图3-5菌株DC02的系统发育树Figure3-5PhylogenetictreeofstrainDC023.5纤维素降解菌的酶活测定3. 5.1标准曲线的制作根据2.2.3的方法制作葡萄糖的标准曲线，绘制标准曲线见图3-6,其线性方程为y=0.7607X+0.0079,R2=0.9993,测定处理后各菌株的待测样品吸光值，根据线性方程计算还原糖的量。1图3-6葡萄糖标准曲线Figure3-6Glucosestandard
29、curve4. 5.2酶活的测定利用DNS法测得三株菌的酶活力如下:时间/d-JE3茎误题7图3-7三株菌的纤维素酶活变化Figure3-7Changesincellulaseactivityofthreestrains在整个培养过程中，菌株DH02,菌株DHOl和菌株DC02的纤维素酶活变化趋势呈现先上升后下降的趋势。3个菌株的纤维素酶活在第四天均达到最大，分别为32.46U/mL、34.24UmL和29.98UmL0其中菌株DHOl纤维素酶活相对较高，而菌株DC02的纤维素酶活相对于菌株DHOl和菌株DH02较低。4.结论与展望4.1 结论1 .1.1实验结果本实验样品来自于牛粪，基于富集
30、能够降解纤维素粉的菌株，经平板划线及培养后初步筛选出6株能解纤维素的细菌，又通过水解圈的大小测定及滤纸条崩解实验后，可以筛出解纤维素能力较好的菌株，经菌株的形态学和分子生物学鉴定，本实验共分离并完成鉴定和保藏菌株3株，包括苏云金芽袍杆菌1株(DH02),枯草芽袍杆菌(DHOl)1株，贝莱斯芽抱杆菌(DC02)1株。在相同的实验条件下，枯草芽抱杆菌DHOl的纤维素酶活性最高，苏云金芽胞杆菌DH02的纤维素酶活性次之，贝莱斯芽胞杆菌DC02的纤维素酶活性在三者中最低。4 .1.2讨论在自然界中存在各种各样的碳水化合物，其中含量最高的非纤维素莫属，然而当前对于纤维素的开发率较低，这不但降低了资源利用
31、率，还容易产生环保问题。通过分析发现，在各种纤维素降解手段中，微生物产能这一手段存在许多优点，比如并不会造成什么污染,而且反应条件也不剧烈等。经分析可知，如今不论是在工业生产里，还是在自然界中，在对纤维素进行降解时，生物降解法是使用频率最高的手段。由前文可知，自然界中主要有细菌等三类微生物可以对纤维素进行降解，此处主要对其中的两类为微生物的优点进行分析：(1)真菌。其不但具备较高的酶活力，而且还具备较大酶量，在酶制剂生产中获得了充分运用。(2)细菌。其不但发酵快，而且培养并不复杂。由此可见，在环境中进行高产纤维素酶的细菌的分离极具必要性。在筛选产纤维素酶菌株时，筛选方式有许多。相关研究发现，像
32、在土壤、动物粪便中，都能够找到这类菌株。比如学者Ahmad等选择牛瘤胃为实验对象，从中完成了芽抱杆菌的分离工作，这类菌株拥有较高的酶活力，能够降解纤维素。学者SUn等选择鹅盲肠为实验对象，从中完成了液化淀粉芽抱杆菌的分离工作，其也具备不错的酶活性。学者MUhamad等选择白蚁肠道为实验对象，从中完成了地衣芽抱杆菌的分离工作。学者徐静静等选择奶牛粪便为实验对象，从中完成了纤维素酶较高菌株的分离工作。学者曹涵文等选择大熊猫粪便为实验对象，从中完成了枯草芽胞杆菌的分离工作。当然需要注意的是，尽管如今得到了许多纤维素降解芽泡菌，然而它们并不具备较高的酶活性，也不具备良好的环境适应能力，所以不适合用于工
33、业化生产中，所以往后需要继续研究，寻找能够用于工业化生活的，具备较高酶活性的菌株。经分析可知，因为牛粪中存在许多纤维素，降解需要花费较长周期，而且也不具备多少营养，这些多不利于对其的规模化运用。在对牛粪进行发酵时，纤维素降解菌扮演了重要角色，在它的影响下，纤维素将变为一些小分子物质和腐熟有机质，由此可见，在堆肥中，各阶段纤维素降解菌能够发现极大作用，当对其进行研究和筛选时，需要考虑的指标有两个，一是糖生成率；二是纤维素降解率。4.2 展望通常情况下，堆肥的原料来源各不相同，也就造成了在成分和性质上的显著区分，此种情况下，向其中添加的微生物菌剂也需要随时进行调整。堆肥的主要原料来源为桔秆，其中主
34、要难以分解的物质为各种类型纤维素及木质素，这也就是意味着需要添加的微生物菌剂为纤维素和木质素等类型的分解菌；堆肥的主要原料来源如果是各种粪便，那么其中会利用到的添加辅料有两种，一种是用来调剂碳氮比的添加物，一种是根据粪便种类的区分来设定该添加哪一种或哪几种微生物菌剂，一般来说会包括芽抱杆菌、链霉菌等多种菌剂。为了消除粪便带来的恶臭气息，可以针对其中的臭味来源也就是硫化氢和氨气，添加具有一定除臭作用的微生物菌剂，有效改善周边环境；堆肥中如果存在较多动物尸体组织，其中具有较高的蛋白等有机质含量，因此可以针对性添加蛋白等类别微生物菌剂。另外需要仔细分辨动物尸体是不是病死，这类型原料病原微生物含量极高
35、，因此要促使堆肥保持足够高的能够有效杀死病原微生物的温度，这也需要添加能够有效提高堆肥温度的针对性微生物菌剂；堆肥的主要原料来源如果是城市垃圾，因为垃圾成分极为复杂，需要具体问题具体对待，针对当次堆肥中垃圾原料的情况来添加相应的微生物菌剂。相关研究者主要有两个微生物来源途径，一个是从堆肥中直接进行分离筛选，一个是直接购买菌剂，研究结果表明，复合菌剂的使用效果和适用范围等方面都比单一菌剂具有更大优势。从资料来看，不同堆肥在添加针对性微生物菌剂后获得的效果几乎等同，能够有效缩短高温到达时间，同时也能提高堆肥温度的上限，从而快速堆肥腐熟，并且对堆肥质量有着显著提高效用，还能够有效降低堆肥中含有的植物
36、类毒性，让使用该堆肥进行种植时获得更高发芽率；与此同时.，微生物菌剂还能够有效提高堆肥中微生物种群的活跃度和多样性，打破其原有的微生物种群构成。目前以堆肥微生物菌剂为课题方向的研究者和研究成果都比较多，但也并非毫无漏洞。在对堆肥微生物展开各种鉴定的过程中普遍采用的还是传统分离法，没有进行优化和适应性改进，导致鉴定结果存在空白区，没有对堆肥微生物进行较为全面而彻底的分离和研究，尤其是其中能够起到作用的那一部分，因此有必要引入更先进和高效的科技和手段，同时以现代生物学为基础，进行堆肥微生物研究方法和手段的创新和研发；另外，当前对以动物尸体为主要原料来源的堆肥微生物研究较少涉及，尤其是对病死动物尸体
37、所带来的具有严重安全隐患的病原微生物如何进行有效灭杀问题；与此同时，对复杂环境中能够起到有效作用的微生物菌剂，也较少涉及，典型场景如严寒地区等；对微生物菌剂的添加时间判断，如何能达到最佳效用等方面研究也还远远不够等。由上可知，要探索微生物菌剂的无害化使用，同时也要促进减量化研究，另外对资源化研究也要加以重视，探寻更多关于堆肥微生物菌剂特性的研究，以便相互借鉴，高效地利用我们的资源。近些年，在对高产纤维素酶降解菌的选育研究过程中，已经不再使用单一的固态或业态发酵的作业方式，而是充分利用现代分子科技，直接进行根源化操作，对菌种施加改良。与此次同时，在对纤维素降解菌的研究过程中，充分利用紫外诱变技术
38、，或者综合利用物理和化学多方面技术进行诱变操作，有效提高了该菌种的竣甲基纤维素酶活性和滤纸酶活性。由此可见，对菌株进行诱导操作时，如果能够有效利用当前的分子科技，并对当前的发酵培养展开针对性优化和改进，显然能够极大提高3株菌种在应用性开发方面的强大潜力。本文轮所涉及的这3株纤维素降解菌距离实际大规模应用还有一段很长的路要走，在牛粪堆肥发酵实验中还有诸多难点有待解决，这是因为堆肥发酵会严重受到客观自然环境变动的影响，如粪便的温度、湿度等都会严重影响到堆肥效率。因此，纤维素酶高产菌选育研究中，如果能够进行更详实更多样的国内实验将有重要促进作用。参考文献杨井泉,张云峰,高磊,沈敏.2株兼具除臭功能的
39、纤维素降解细菌的分离鉴定J.家畜生态学报,2018,39(09)：46-51.郑国香，艾爽，尹婷，李健.耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化UL东北农业大学学报，2019,50(02)：79-89.孟建宇，丁雪敏.低温嗜碱性纤维素降解细菌的分离与鉴定J.中国饲料，2020(11)：31-33.沈琦，孙宏，王新，吴逸飞，姚晓红，李园成，汤江武.猪粪中嗜热纤维素降解菌的筛选及其除臭特性研究J.中国畜牧杂志，2020,56(10)：162-166.张国盛，颜婉茹，陈春亮，李掌印，李亚男，何新超.低温环境下秸秆降解菌的筛选与性能检测JL化学工程师,2020,34(01)：6-9.佟硕秋，王婿,
40、林宗梅，陶怡,吴拥军.纤维素降解菌研究进展J.山东化工，2020,49(03)：67+91.熊乙，杨富裕，倪奎奎，许庆方.微生物在木质纤维素降解中的应用进展J.草学，2019(05)：1-7.王盼星，陶施淼,薛藩.纤维素降解菌研究进展J.绿色科技,2018(12)：161-163.9曹慧，任世威，张腾月，秦亚宁，张兰，杨佳萌，张朋振.青藏高原低温纤维素降解菌的筛选与酶学特性JOL.饲料工业：I-62021-01-05.10李健.三株耐低温纤维素降解菌的筛选及性能研究D.东北农业大学，2018.Ul吴庆珊.纤维素降解菌筛选及其在羊粪堆肥发酵中的应用D.贵州师范大学，2018.12郭欣慧.堆肥过程
41、中纤维素降解菌的筛选及N素原位保全技术研究D.东北农业大学，2018.13诸葛诚祥.菌糠高效降解菌剂的研发及其在堆肥中的应用D.浙江大学，2017.14杨林丽.纤维素降解菌筛选及混合菌种纤维素降解能力测定D.西北农林科技大学，2013.15曹典军，邓鹏，丰来，郭帅，周法永.零排放养猪中原位降解菌的筛选和菌种组合效果研究A.中国微生物学会农业微生物学专业委员会、中国土壤学会土壤生物和生物化学专业委员会、中国植物营养与肥料学会微生物与菌肥专业委员会、农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心.第十一届全国土壤微生物学术讨论会暨第六次全国土壤生物与生物化学学术研讨会第四届全国微生物肥料生产技术
42、研讨会论文(摘要)集C.中国微生物学会农业微生物学专业委员会、中国土壤学会土壤生物和生物化学专业委员会、中国植物营养与肥料学会微生物与菌肥专业委员会、农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心：中国土壤学会土壤生物和生物化学专业委员会，2010：5.16张恒，张应杰，陆昌龙.生活垃圾可发酵物降解菌的筛选.安徽农业科学，2005(10)：117-118+200.17张爽.低温纤维素降解菌的筛选及其玉米秸秆降解效果研究D.东北农业大学，2018.18张凯帅.纤维素降解菌筛选及基于宏基因组克隆表达纤维素酶基因D.内蒙占农业大学，2018.19刘震飞.秸秆木质纤维素降解菌的筛选及发酵工艺优化的研
43、究D.兰州交通大学，2018.20郑国香，赵欣，李健.一组耐低温纤维素降解菌系培养条件优化及产酶分析J.东北农业大学学报，2017,48(04)：61-68.21李春艳，于琦，冯露，成毅，成小松，王雪，张平根.低温纤维素降解菌分离鉴定及产酶条件优化J.东北农业大学学报，2015,46(10)：74-81.22勾长龙，王雨琼，王巍，赵哈旭，娄玉杰，高云航.两株长白山地区低温纤维素降解真菌的筛选鉴定及其产酶条件优化J.中山大学学报(自然科学版)，2015,54(05)：115-121+129.23侯会利.牛粪固体物堆肥制作卧床垫料的效果及其低温纤维素降解菌的筛选D.内蒙占农业大学，2015.24罗
44、立津，万立，陈宏，温翠莲，徐福乐，贾纬，聂毅磊，袁红莉.耐低温木质纤维素降解菌群的富集培养及其种群结构分析J.农业生物技术学报，2015,23(06)：727-737.25李鹤，张恒芳，秦治家，高云航，娄玉杰，刘淑霞.低温秸秆降解菌的研究进展J.中国农学通报，2014,30(33)：116-119.26黄颖婕,周尚峰,刘震夷,岳勇志,李祖任,郭腊梅,王立峰.牛粪堆肥纤维素高效降解菌的筛选和应用J.湖南农业科学,2018(02):50-53.27毛婷,魏亚琴,杨红建,牛永艳,陈娟,王治业.耗牛粪便中纤维素降解菌的筛选及产酶优化J.中国农业大学学报,2019,24(11):106-116.28李林超,张超,董庆,郭成,周波,高峥.堆肥过程中纤维素降解菌的分离与鉴定J.生物技术通JR,2019,35(09):165-171.29方华舟,王培清.牛粪堆肥各阶段主要纤维素降解菌分离与作用规律分析J.中国土壤与肥料,2012(06):88-92.30乔健敏,岳林芳,成立新,郑重,李子健,凤英,李蕴华,王志铭,宝华,于朝晖.肉牛粪污中纤维素降解菌的分离筛选J.畜牧与饲料科学,2019,40(11):79-83.
