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1、第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程(Geneticengineering)原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之依据人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。1.分别目的基因2 .限制酶切目的基因与载体3 .目的基因和载体DNA在体外连接4 .将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培育5 .选择、筛选含目的基因的克隆6 .培育、视察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1 .基因工程载体必需满意哪些基本条件？具有对受体细胞的
2、可转移性或亲和性。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有合适的筛选标记。分子量小，拷贝数多。具有平安性。2 .质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3,质粒的构建(1)删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。(2)灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组试验的平
3、安，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数(3)加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。(4)在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别与切割位点的DNA序列，即多克隆接头(POlylinker),便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的精确插入。(5)依据外源基因克隆的不同要求，分别加装特别的基因表达调控元件。4 .什么是人工染色体载体？将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、安排区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体5 .什么是穿梭载体
4、？人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。6 ,入-噬菌体载体与构建-DNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性灭活某些与裂解周期有关基因。使入-DNA载体只能在特别的试验条件下感染裂解宿主细菌，以避开可能出现的污染现象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测7 .M13单链噬菌体DNA载体过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半
5、乳糖昔酶氨基端编码序列dacZ,)的乳糖操纵子片段(lac)、组氨酸操纵子片段(his)以与抗生素抗性基因等。将人工合成的多克隆位点接头片段插在IacZ标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。(4)在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列，使得重组DNA分子的单链形式经分别纯化后，可干脆进行测序反应。8 .II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶(Restrictionendonucleases)是一类能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常
6、是由4、5或6核甘酸组成的特定序列(靶序列)。识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核甘酸依次呈回文结构。切割位点的规范性：双链DNA被附切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称(可形成粘性末端或平末端的DNA分子)。同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶(Isocandamers):识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。9 ,甲基化酶U类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。
7、甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。10 .DNA连接酶连接作用的特点：DNA连接醐须要一条DNA链的3,末端有一个游离的羟基(-OH),另一条DNA链的5末端有一个磷酸基(-P)的状况下，只有在这种状况下，才能发挥连接DNA分子的作用。只有当3一。H和5-P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核昔酸末端时，DNA连接前才能将它们连接成磷酸二酯键。DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单
8、链DNA分子，被连接的DNA链必需是双螺旋DNA分子的一部分。DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口(nick),而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核昔酸所形成的单链裂口(gap)。由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连接反应时，还须要供应一种能源分子(NAD+或ATP)11 .大肠杆菌DNA聚合酶和KlenOW大片段各有什么作用？DNA聚合酶作用的特点：要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA。接受模板指导须要有引物（3羟基）的存在。不能起始合成新的DNA链。催化dNTP加到生长中的DNA链3-OH末端。催化
9、DNA的合成方向是53,oKlenow酉每的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶。分子量为76kDaoKlenoW酶仍拥有53,的DNA聚合酶活性和5-3的核酸外切酶活性，但失去了53,的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：修复由限制性核酸内切酶造成的3,凹端，使之成为平头末端。以含有同位素的脱氧核甘酸为底物，对DNA片段进行标记。用于催化CDNA其次链的合成。用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。12 .T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：A有35,的核酸外切酶活性和53,的DNA聚合酶活性
10、。在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切。在只有一种dNTP时，外切至互补核昔酸。在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切醺产生的3粘性末端13 .影响连接效率的因素有：温度（最主要的因素）离子浓度ATP的浓度（10M-1M）连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比DNA末端性质DNA片段的大小.如何将不同DNA分子末端进行连接？1.相同粘性末端的连接假如外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，两种DNA分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能顺当的连接成一
11、个重组DNA分子2 .平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作不常常采纳。3 .不用粘性末端的连接3,端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5端的粘性末端用klenow酶补平，或者用Sl核酸酶切平最终用T4-DNA连接酶进行平末端连接.碱性磷酸酶有什么作用？1.该酶用于载体DNA的5末端除磷操作，以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5,端除磷，则可有效防止外源DNA片段之间的连接。15 .末端脱氧核昔酸转移酶有哪些作用？给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾。DNA片段3末端的同位素标记。16 .2、细
12、菌转化的步骤：感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割与加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等。转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA双链RNA以与DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。转化因子的汲取。双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被汲取到受体菌中。整合复合物前体的形成。进入受体细胞
13、的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地爱护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。17 .Ca2+诱导转化原理：在OCC的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNaSe)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42。C热刺激短暂处理细菌细
14、胞时，细胞膜的液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子供应了进入细胞的通道。Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采纳。18 .PEG介导细菌的原生质体转化PEG是乙二醛的多聚物，存在不同分子量的多聚体,它可变更各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合。19 .电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA干脆通过这些微孔或
15、者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。P52接合转化，入噬菌体感染未归纳20 .转化率的影响因素.载体与重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体。插入片段大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必需与载体相匹配转化操作的影响21 .转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培育。在试验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37。C培育一个
16、小时原生质体转化后的再生过程入噬菌体转染后的30。C培育等，均属扩增操作扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。表达外源基因，便于筛选和鉴定。23 .抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法Q抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子
17、影印至含有Tc的平板上在AP平板上生长，但在TC平板上不长的转化子即为重组子P56抗药性标记插入失活选择法经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括须要的重组子，也含有不须要的非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。假如外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活，这种抗药性标记就会消逝，从而筛选出阳性重组子。24 .什么是蓝白斑筛选法？这种方法是依据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌一半乳糖甘酶的基因片段，携带有IaC基因片段的载体转入IaC的宿主菌后，在含有5一澳一4一氯一3一引噪一一D一半乳糖甘(X-gal)平
18、板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或Iac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丢失分解X-gal的实力，转入IaC-宿主菌后，在含有5一澳一4一氯一3一引噪一一D一半乳糖昔(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。25 .PCR筛选法利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。由于在载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的，可以设计合成相应的PCR引物，以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，若出现特异性扩增DNA带，并且
19、其分子量同预期的一样，则可确定含此重组DNA分子的重组子是期盼的重组子。第三章基因工程的常规技术1.探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？类型：同源或部分同源探针CDNA探针人工合成的寡核甘酸探针标记方法：5端标记法反转录标记法缺刻前移标记法ABC标记法4 .什么是ABC荧光（显色醮）标记法？ABC标记法。 A为AVidin（生物素抗性蛋白），每个AVidin分子可结合3-4个生物素分子； B为BiOtin（生物素），每个BiOtin分子可结合2个AVidirI分子;C为ComPIex,首先将BiOtin共价结合在探针分子上，荧光胺标记在AVidin上，两者形成复合物，即可将荧光胺标记在探针上，
20、发出的荧光也能使一般胶片感光。假如将某一生色酶接在AVidin上，并辅以合适底物，则杂交反应还可干脆以颜色反应检测，这一技术称为酶标技术5 .亚克隆法亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切醐切割后，将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞，然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定，获得含有目的基因的重组子。此时，该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除。6 .菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程该项技术是干脆把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落。操作
21、步骤：菌落生长转移到NC膜上DNA释放和变性（变成单链DNA）:10%SDS0.5MNaOH中和0.5MTris-HClPH8.0固定80120,杂交（包括预杂交，加探针DNA杂交）放射自显影比照比较，选出重组克隆7鸟枪法鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小相宜的DNA片段，分别连接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的期望重组子。鸟枪法制备目的基因的主要步骤目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。（原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变更很大,最大的基因可达WOKb以上）。全酶切：片段长度不均一
22、，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不行控。部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。DNA片段与载体连接假如转化子采纳菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；假如转化子采纳基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。重组DNA分子导入受体细胞假如转化子采纳菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；假如转化子采纳基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的DNA片段，必需通过次级
23、克隆或插入灭活，在已克隆的DNA片段上精确定位目的基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以与可能存在的表达调控序列。8 .cDNA法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分别的目的基因。这种方法以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的CDNA克隆。9 .mRNA的分别纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3端都存在一个多聚腺甘酸的尾巴,利用它可以快速的将mRNA从细胞总的混合物中分别出来，将寡聚脱氧胸腺嗑咤共价交联在纤维素分子上，制成亲和层析
24、柱，然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分别，mRNA会挂在层析住上，后洗脱即可分别10.简述PCR技术的基本原理，PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？PCR技术的基本原理：类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。过程：PCR由变性-退火一延长三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右肯定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作打算；模板DNA与引物的退火（复性）:模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55。C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延长：
25、DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性一退火一延长三过程，就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。11 .什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备须要时能够随时应用它分别所须要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称DNA文库。基因组文库构建的一般步骤载体的选择和制备高纯度
26、、大分子量基因组DNA的提取。基因组DNA的部分酶切与分级分别。载体与DNA片段的连接。转化或侵染宿主细胞。筛选鉴定基因组与保存。12 .基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个志向的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避开基因被分隔克隆。克隆与克隆之间必需存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。基因文库的构建通常采纳鸟枪法和CDNA法13 .外源DNA片段的切割原则1 .DNA片段之间要有肯定的重叠序列2 .DNA片段大小要均一14 .cDN
27、A文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分别第一链CDNA合成其次链CDNA合成双链CDNA的分级分别双链CDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1 .启动子启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列，其大小在20300个碱基，是限制基因转录的重要调控元件。在肯定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱亲密相关，而转录又在很大程度上影响基因的表达。启动子的特征：序列特异性方向性位置特性种属特异性2 .启动子类型组成型启动子：是指在该类启动子限制下，结构基因的表达大体恒定在肯定水平上，在不同组织、部位表达水平没有
28、明显差异。组织特异启动子：又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现动身育调整的特性。诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分别了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。3 .终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列，基因转录时，该序列被转录为mRNA的一部分，并形成特别的二级结构，由此终止基因的转录。4.SD序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核甘酸处有一段富含噤吟核甘酸的
29、依次，它可以与30S亚基中的16SrRNA3,端富含喀呢的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处起先5 .密码子不同生物对密码子的偏爱性1 .生物体基因组中的碱基含量2 .密码子与反密码子的相互作用的自由能3 .细胞内tRNA的含量6 .密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的运用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因7 .包涵体与其性质在某些生长条件下，
30、大肠杆菌能积累某种特别的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包袱或形成无膜袒露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体8 .包涵体的形成机理折叠状态的蛋白质集聚作用。非折叠状态的蛋白质集聚作用蛋白折叠中间体的集聚作用。9 .包涵体的分别检测包涵体的分别主要包括菌体破裂、离心收集以与清洗三大操作步骤。10 .分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质干脆分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培育基中，这一过程严格依靠于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯醐A,导致细菌内外膜的通透性增大因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个
31、合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并运用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。11融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简洁纯化。外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白供应终止密码子。在某些状况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避开融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分别回收创建条件。两个结构基因拼接位点处的序列设计非常重要，它干脆确定着融合蛋白的裂解工艺。两个蛋白编
32、码序列应保持一样的翻译阅读框架。12.志向变性剂的特点1.变形溶解速度快2 ,对包含体中残留细胞碎片的分别没有干扰3 .无温度依靠性4 .对蛋白酶没有抑制作用5 .对蛋白质的氨基酸侧链基团无化学反应活性13.哺乳动物细胞的物理转化法1.磷酸钙共沉淀法2.电击转化法3脂质体介导法4.显微注射法第五章基因治疗1 .基因治疗的概念与策略是什么？基因治疗：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以订正或补偿因基因缺陷和异样引起的疾病,以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。基因治疗策略：干脆基因治疗和间接基因治疗2 .基因治疗的基本程序是怎样的？基因治疗包括基因诊断、基因分别、载体构
33、建和基因转移四项基本内容。3 .基因治疗的分子机制正常基因：从健康人体内分别克隆，它或通过同源重组方式置换病变基因，或依靠其表达产物弥补病变基因的非功能性蛋白的生理作用。这类基因通常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病，如血友病、地中海贫血病以与由腺苜脱氨酶（ADA）基因缺陷所致的重度联合免疫缺陷症等。反义基因：用于治疗病毒感染或肿瘤疾病。反义基因的体内表达产物（反义RNA）或与病毒的激活因子编码基因互补（如艾滋病毒HIV）,或与肿瘤基因的mRNA互补（如食道癌癌基因cmyc）,从而阻断其表达。自杀基因：用于治疗癌症。很早人们就发觉在病毒、细菌和真菌中存在一些酶，它们能将细胞中一些原本无毒的代谢物转
34、化为毒性化合物，而这些酶在动物体内是不存在的。假如将它们转入肿瘤细胞，再辅以原代谢物或药物，就能杀灭癌细胞。因此这类酶称为自杀酶，相应的基因则为自杀基因。第八章途径工程1 .途径工程定义依据底物在代谢反应中对通用性酶和特异性酶的运用要求，可将细胞内全部的生物分子分成两大类：一级基因产物，如tRNA、rRNA多糖、酯类、蛋白质和核酸等，其生物合成和分解只须要有限的几种通用性的酶与蛋白因子，包括RNA聚合酶、RNA剪切酶、DNA聚合酶、糖甘酶、脂酶、氨酰基-tRNA合成酶、肽基转移酶、核酸酶等二级基因产物，如氨基酸、维生素、抗生素、核甘酸等小分子化合物，它们的生物全合成和降解少则涉与几个基因多则须
35、要几十个基因所编码的醯系，而且这些酶大都具有运用的特异性。上述合成和分解二级基因产物的酶系与其催化的生化反应，构成了一个个相互联系的代谢网络。它们均由若干个串联和并联的简洁子途径组成，其中各子途径的并联交汇点称为节点。细胞代谢途径实质上就是与一组特定的流入和流出代谢物质相联系的任何一个合理可视察的生化反应序列。途径工程(PathwayEngineering)：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径与遗传修饰、进而完成细胞特性改造的应用性学科。2 .途径工程基本过程靶点设计依据代谢流分布和限制的分析结果确定途径操作的合理靶点，通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或者拟阻断途径的靶点等。值得强调的是，靶点设计对途径工程的成败起着关键作用，任何精细的靶点选择都必需经得起细胞生理特性以与代谢网络热力学平衡的检验。基因操作利用途径工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作，其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以与重组基因在目标细胞染色体DNA上的稳定整合。效果分析对新途径进行全面的效果分析，由初步途径操作构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷可以作为新一轮试验的改进目标。正像蛋白质工程试验所采纳的探讨策略，如此反复进行遗传操作即可获得优良物种。
