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1、长治医学院大学生创新创业训练项目研究过程记录册项目名称：紫外照射对角化细胞诱导黑色素胞外分泌机制的研究项目编号：项目级别：省级负责人：渠海霞其他成员：渠海霞郝奕楠刘航申冀所在学院：第一临床学院指导教师：执行时间：2021年10月9日至2022年3月1_0长治医学院教务处二O二二年三月填写说明1 .长治医学院大学生创新创业训练计划项目研究过程记录册是检查项目研究进展情况的主要依据，也是评价项目研究成果的重要依据之一。项目负责人必须认真、及时、准确、真实地记录项目研究的主要过程。2 .长治医学院大学生创新创业训练计划项目研究过程记录册主要记录项目研究进展情况，如：成功的经验、失败的原因、与指导教师
2、的交流、团队合作、经费使用明细等方面内容，要求全过程记录次数不少于30次。3 .项目负责人及成员应定期请指导老师查阅项目研究过程记录，与指导老师进行交流和研讨。4 .中期检查时项目负责人需将长治医学院大学生创新创业训练计划项目研究过程记录册交指导教师检查和签字后，再交学校教务处。5 .项目结束后，由项目负责人将长治医学院大学生创新训练计划项目研究过程记录册及相关材料提交指导教师检查和签字后，再提交学校教务处进行核实、存档保管。6 .本记录册平时由项目负责人保存。长治医学院大学生创新创业训练项目合同为了保证长治医学院“大学生创新创业训练项目”的正常实施及项目经费的有效使用，学校教务处与立项的项目
3、负责人特签订本合同，本合同自签订之日起生效。1 .合同对象：立项文件中所列的各项目负责人签订本合同书，各项目的详细信息以申报书内容为准。2 .项目负责人应确认本项目的立项经费，并制定详细的经费使用计划，保证做到节约开支、专款专用，不得弄虚作假，经费使用严格按照长治医学院本科教学改革与质量工程专项经费管理暂行办法（长医教字20165号）执行。3 .项目负责人保证按时按要求认真完成各阶段工作。特别是结题时，应及时向学校提交结题相关材料（结题报告和发表论文、成果实物及其相关证明材料），逾期不交且未申请延期者该项目自动终止,学校将收回所有结余经费。4 .项目成员若需变动，由项目负责人向学校教务处提出书
4、面申请，并由变动人员、项目负责人、指导老师签字后，同时教务处负责人签字同意方可生效。5 .各项目负责人及项目成员应积极参与学校“大学生创新创业训练计划”的相关活动。项目负责人签字：渠海霞 指导教师签字：杜斌教务处负责人签章:2021年10月7日2021年10月7日大学生创新创业训练项目承诺书为确保大学生创新创业项目顺利实施，本项目承诺遵守以下条款要求:1 .在项目实施的全过程中实事求是、诚实守信。2 .项目经费严格按学校大学生创新创业训练项目的有关规定执行，专款专用。3 .接受学校教务处对本项目的检查和监督。4 .保证项目在毕业前提前一学期完成，并按时提交结题报告及有关研究成果、仪器设备验收证
5、明等材料。5 .因本项目组成员主观原因致使项目无法执行的，将视情况退回所有结余资助经费。6 .项目组的成果如需保密，遵守学校有关规定执行。7 .项目组的发明或创新属学校职务发明创造，由学校协助申报专利。8 .本承诺书由本项目全体成员及指导老师签字并经教务处确认后生效，如有违反，本人愿承担责任。9 .本承诺书作为项目管理和经费划拨的依据，项目结题后由学校教务处存档。项目负责人签字：渠海霞指导教师签字：杜斌项目组成员（签字）：渠海霞郝奕楠刘航申冀2021年11月5日1 .经费使用明细（总经费：5000元）单位：元序号日期经费使用摘要金额余额报销人审核人12021.12.5大创项目试剂耗材购买500
6、00杜斌23456789100寸m2 .项目研究过程记录时间过程记录1复苏黑色素细胞，角化细胞1 .从液氮罐中将含有黑色素细胞和角化细胞的冻存管取出，迅速浸入37摄氏度的水浴锅中，轻轻的来回晃动使其能够较快的融化。2 .酒精消毒后放进超净台中，开启冻存管，用移液器吸出细胞悬液，加入4ml培养基，常温K)OOrPmmin离心IOmin,弃去上清O3 .用黑色素细胞专用培养基重悬细胞，按照适宜的浓度接种，放入CO2细胞培养箱中静置培养，次日观察并更换培养基，继续培养。项目记录人：渠海陵2021年10月8日2换液1 .从培养箱中取出细胞培养瓶，用酒精喷壶在瓶子表面喷洒75%酒精消毒，转移到超净台，打
7、开盖子，轻轻吸出旧的培养液，可用移液器加入新鲜的含血清培养基，注意一定不要从细胞贴壁面加入培养基础。2 .加好培养基后，盖上盖子，在瓶子上做好标记，注明换液时间，细胞种类，操作人员等信息。3 .培养瓶喷洒酒精后放入培养箱中，整理好操作台。项目记录人：渠海陵2021年10月10日2 .项目研究过程记录时间过程记录细胞培养角化细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，待细胞生长至未完全聚合时吸掉原培养基，PBS清洗细胞两次，加入0.25%胰蛋白薛室温消化至细胞脱落，加入3倍于使用的胰酶体积的完全培养基终止消化,将细胞收集于15ml离心管中IooOrpm离心3min至上层液体澄清。弃去上清
8、后使用新鲜的完全培养基重悬细胞并稀释至合适的浓度并接种。项目记录人：郝奕楠2021年10月14日传代1.当细胞密度达到85%90%时，将培养瓶中的培养基吸去弃掉，加入提前配好的胰蛋白薛消化液，盖好培养瓶并轻轻晃动，使消化液可以完全覆盖细胞层，将培养瓶放入CO2培养箱中37摄氏度消化5min02,从培养箱中拿出培养瓶，将其放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，细胞变成亮泡时应立即中止消化。直接加入完全培养液，终止消化。3 .使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。用计数板计数后，分别接种于新
9、的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。项目记录人：郝奕楠2021年10月18日2.项目研究过程记录时间过程记录5铺板1 .吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液，向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。2 .置37C孵箱或室温（25温度）下进行消化，25min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。3 .通过血细胞计数板计数为40,之后将细胞传入培养皿中，最后将培养皿放入培养箱中。项目记录人：郝奕楠2021年10月22日6紫外照射1 .将做有特殊标记的黑色素细胞培养皿放
10、入超净工作台中，把培养皿的的皿盖打开。将没有做标记的黑色素细胞放入相同环境的超净台中。2 .将做有标记的培养皿直接暴露在紫外线下，距离紫外灯约30cmo没有做标记的培养皿不照射紫外线。3 .两个培养皿在超净台中放置相同时间。项目记录人：渠海陵2021年10月26日2.项目研究过程记录时间过程记录代谢组分学分析我们测序结果显示，富集到了黑色素生成和转运的众多基因如TYR、TYRP1、DCT和膜转运蛋白SLC24A5等，最重要的是富集到了一些新型基因这为我们进一步探究黑色素生成和转运提供了强有力的理论依据项目记录人：刘航2021 年10月30 日蛋白质免疫印迹(WeStembIOt)检测蛋白水平细
11、胞处理24h后，预冷PBS清洗细胞3次，将预冷的裂解液加入培养细胞所用的培养皿或培养瓶中，冰上用细胞刮刀将细胞刮下，将裂解液同细胞移至新的L5mlEp管中冰上裂解30min,4P12000g离心IOmii1,100。C金属浴Iomin充分变性蛋白。电泳、转膜后，5%脱脂奶粉封闭PvDF膜室温1h,之后4。C孵育一抗过夜,TBST清洗PvDF膜5min3次，二抗室温孵育1h,PBS清洗PVDF膜5min3次，暗室中滴加ECL显色剂曝光，经显影，定影后晾干胶片，扫描仪扫描胶片。2.项目研究过程记录时间过程记录黑色素细胞总蛋白质的提取培养黑色素细胞，进行转染。待转染结束后，取出整板细胞，移去培养基，
12、用预冷的PBS冲洗细胞M次,最后用ImL的PBS覆盖细胞以防细胞脱水死亡。弃去PBS,将培养板置于冰上，每孔加入事先配好的的裂解液400uL(含有浓度为I(X)UgmL的PMSF),使细胞充分裂解。收集含有细胞碎片的裂解液到高温灭菌处理过的1.5mL的EP管中，冰中裂解30mino94,13000rpmmin,离心5min,测定浓度后将上清分装于02mL的EP管中，每管20uL,做好标记，-80保存。项目记录人：渠海陵2021年11月8日沉淀法检测黑色素含量1 .收集各组细胞上清，Iooormp、5mi弃细胞沉淀，收集上清IoOoonnp、30min,收集黑色素2 .将细胞消化终止后，离心Io
13、oOrmp、5min,细胞沉淀备用。3 .向所得的细胞沉淀中加入IMNaoH爆制)，充分振荡后于80摄氏度金属浴30min10时间到后于47Onm处检测吸光度值，黑色素含量计算：黑色素含量=A/细胞数项目记录人：郝奕楠2021年11月12日2.项目研究过程记录时间过程记录qPCR检测相关因子表达量1 .、从细胞中提取RNA细胞：六孔板每孔细胞中加入ImlTri201,冰上放置5min,枪头吹打；再将各孔裂解液吸到L5mlEP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。1530七下孵育23min,离心(4,12,000g,15min)。离心后液体分为三层(上层一无色水样层为RNA,中层白色为D
14、NA和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中；然后加入等体积异丙醇，0.4-0.5ml,混匀，1530下孵育103Omin,离心(4,12,OOOg,10min)o接着去上清，沉淀加入75%乙醇1ml,漩涡振荡30s,离心(4,7,500g,5min)o离心后去上清，管内沉淀在超净台中鼓风管置干燥35min最后加入20UlDEPC水溶解，分装5ul管，70冰箱保存。2 .去除基因组DNA用全波长酶标仪测出RNA浓度按照以下剂量配制IouI体系试剂使用量5XDNAEraserBuffer2lBuffer2.0lgDNAEraser1uiTotalRNAlug/RNA浓度RNa
15、SeFreedH20UPtOlOUIpCR程序：421C2min4C3 .逆转录成cDNA:按照以下剂量配制20Ul体系：试剂使用量步骤1的反应液10UlPrimeScriptRTEnzymeMix11ulRTPrimerMi1ul5XPrimeScriptBuffer2(for11RealTime)4ulRNaseFreedH2O4ulTotal20ulPCR程序：37(C15min85C5s4(C8四、配置QPCR预Per液按照以下剂量配制20Ul体系：试剂使用量SYBRPremixEXTaq11(2X)10ulFPrimer(IOuM)0.8ulRPrimer(IOuM)0.8ulROX
16、Reference110.4ul反应2的DNA模板2ulddH2O6ul配置完成后QPCR96孔板排版加样，3个复孔五、上机QPCR仪器检测后根据CT值分析实验结果。12复苏黑色素细胞，角化细胞4 .从液氮罐中将含有黑色素细胞和角化细胞的冻存管取出，迅速浸入37摄氏度的水浴锅中，轻轻的来回晃动使其能够较快的融化。5 .酒精消毒后放进超净台中，开启冻存管，用移液器吸出细胞悬液，常温100orPmmin离心IOmin,弃去上清，用PbS重悬细胞，再次离心。6 .用黑色素细胞专用培养基重悬细胞，按照适宜的浓度接种，放入CO2细胞培养箱中静置培养，次日观察并更换培养基，继续培养。项目记录人：渠海度20
17、21年11月20日2.项目研究过程记录时间过程记录换液4 .从培养箱中取出细胞培养瓶，用酒精喷壶在瓶子表面喷洒75%酒精消毒，转移到超净台，打开盖子，轻轻吸出旧的培养液，可用移液器加入新鲜的含血清培养基，注意一定不要从细胞贴壁面加入培养基础。5 .加好培养基后，盖上盖子，在瓶子上做好标记，注明换液时间，细胞种类，操作人员等信息。6 .培养瓶喷洒酒精后放入培养箱中，整理好操作台。13项目记录人：渠海陵2021年11月24日细胞培养14角化细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，待细胞生长至未完全聚合时吸掉原培养基，PBS清洗细胞两次，加入0.25%胰蛋白睡室温消化至细胞脱落，加入3倍
18、于使用的胰酶体积的完全培养基终止消化，将细胞收集于15ml离心管中，100Orpm离心3min至上层液体澄清。弃去上清后使用新鲜的完全培养基重悬细胞并稀释至合适的浓度并接种。项目记录人：郝奕楠2021年11 月24日2.项目研究过程记录时间过程记录传代4 .当细胞密度达到85%90%时，将培养瓶中的培养基吸去弃掉，加入提前配好的胰蛋白酶消化液，盖好培养瓶并轻轻晃动，使消化液可以完全覆盖细胞层，将培养瓶放入CO2培养箱中37摄氏度消化5min05 .从培养箱中拿出培养瓶，将其放在倒置显微镜下进行观察，当细胞变成亮泡时后，应立即中止消化。吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液,
19、终止消化。156 .使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。16铺板4 .吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液，向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。5 .置37C孵箱或室温（25温度）下进行消化，25min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。6 .通过血细胞计数板计数为40,之后将细胞传入培养皿中，最后将培养皿
20、放入培养箱中。项目记录人：郝奕楠2021年12月2日2.项目研究过程记录时间过程记录17紫外照射4 .将做有特殊标记的黑色素细胞培养皿放入超净工作台中，把培养皿的的皿盖打开。将没有做标记的黑色素细胞放入相同环境的超净台中。5 .将做有标记的培养皿直接暴露在紫外线下，距离紫外灯约30cmo没有做标记的培养皿不照射紫外线。6 .两个培养皿在超净台中放置相同时间。项目记录人：渠海陵2021年12月8日代谢组分学分析我们测序结果显示，富集到了黑色素生成和转运的众多基因如TYR、TYRP1、DCT和膜转运蛋白SLC24A5等，最重要的是富集到了一些新型基因这为我们进一步探究黑色素生成和转运提供了强有力的
21、理论依据项目记录人：刘航2021年12月12日2.项目研究过程记录时间过程记录蛋白质免疫印迹(WeStembIOt)检测蛋白水平细胞处理24h后，预冷PBS清洗细胞3次，将预冷的裂解液加入培养细胞所用的培养皿或培养瓶中，冰上用细胞刮刀将细胞刮下，将裂解液同细胞移至新的L5mlEp管中冰上裂解30min,4P12000g离心Iomii,100。C金属浴Iomin充分变性蛋白。电泳、转膜后，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜室温1h,之后4。C孵育一抗过夜,TBST清洗PVDF膜5min3次，二抗室温孵育1h,PBS清洗PVDF膜5min3次，暗室中滴加ECL显色剂曝光，经显影，定影后晾干胶片，扫描仪扫描
22、胶片。19项目记录人：渠海陵2021年12月16日20黑色素细胞总蛋白质的提取培养黑色素细胞，进行转染。待转染结束后，取出整板细胞，移去培养基，用预冷的PBS冲洗细胞M次,最后用ImL的PBS覆盖细胞以防细胞脱水死亡。弃去PBS,将培养板置于冰上，每孔加入事先配好的的裂解液400uL(含有浓度为I(X)UgmL的PMSF),使细胞充分裂解。收集含有细胞碎片的裂解液到高温灭菌处理过的1.5mL的EP管中，冰中裂解30mino4,13000rpmmin,离心5min,测定浓度后将上清分装于0.2mL的EP管中，每管20uL,做好标记，-80保存。项目记录人：渠海陵2021年12月20日2.项目研究
23、过程记录时间过程记录沉淀法检测黑色素含量4 .收集各组细胞上清，IooOrmp、5min弃细胞沉淀，收集上清IooOomp、30min,收集黑色素5 .向细胞沉淀中加入200微升纯水重悬细胞，再加入Iml乙醇/乙酰混合液（体积比1:1）,充分摇匀并于温室下瞥置15min时间到后，该混合物于300OmIP,5min条件下继续离心，弃去上清液，沉淀备用。6 .向所得的细胞沉淀中加入200微升lml20%的DMSO（用NaoH配制），充分振荡后于80摄氏度条件下封口放置30min0时间到后于47Onm处检测吸光度值，黑色素含量计算：黑色素含量=A/细胞数项目记录人：郝奕楠2021 年12月24日qP
24、CR检测相关因子表达量4 .、从细胞中提取RNA细胞：六孔板每孔细胞中加入ImlTri201,冰上放置5min,枪头吹打；再将各孔裂解液吸到L5mlEP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。1530七下孵育23min,离心(4,12,000g,15min)。离心后液体分为三层(上层一无色水样层为RNA,中层白色为DNA和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中；然后加入等体积异丙醇，0.4-0.5ml,混匀，1530下孵育103Omin,离心(4,12,OOOg,10min)o接着去上清，沉淀加入75%乙醇1ml,漩涡振荡30s,离心(4,7,500g,5min)o离
25、心后去上清，管内沉淀在超净台中鼓风管置干燥35min最后加入20UlDEPC水溶解，分装5ul管，70冰箱保存。5 .去除基因组DNA用全波长酶标仪测出RNA浓度按照以下剂量配制IOuI体系试剂使用量5XDNAEraserBuffer2lBuffer2.0lgDNAEraser1uiTotalRNAlug/RNA浓度RNaSeFreedH20UPtOloUIpCR程序：421C2min4C226 .逆转录成cDNA:按照以下剂量配制20Ul体系：试剂使用量步骤1的反应液10UlPrimeScriptRTEnzymeMiX11ulRTPrimerMi1ul5XPrimeScriptBuffer2
26、(forRealTime)4ulRNaseFreedH2O4ulTotal20ulPCR程序：37(C15min85C5s4(C8四、配置QPCR预Per液按照以下剂量配制20Ul体系：试剂使用量SYBRPremixEXTaq11(2X)10ulFPrimer(IOuM)0.8ulRPrimer(IOuM)0.8UlROXReference110.4ul反应2的DNA模板2ulddH2O6ul配置完成后QPCR96孔板排版加样，3个复孔五、上机QPCR仪器检测后根据CT值分析实验结果。项目记录人：申冀2021 年 12月30日2.项目研究过程记录时间过程记录23项目记录人：年月日24项目记录人
27、：年月日2.项目研究过程记录时间过程记录25项目记录人:年月日26项目记录人：年月日2.项目研究过程记录时间过程记录27项目记录人：年月日28项目记录人：年月日3中期检查记录进展情况：完成了基本的步骤，但实验中出现了细胞生长情况不理想的现象，又重新培养了细胞。存在问题：1.细胞培养出现了污染现象，需要重新培养细胞。2 .做的蛋白质免疫印迹(WeStemblot)最后的成片效果不是很理想，需要再次实验。3 .代谢组分分析，最后的效果不理想，需要再次进行实验。下步计划：振作精神，重新做之前结果不理想的实验，争取取得预期的实验结果。自评(进展情况、存在问题、下一步工作计划)丽日虚吊，抹字1举海雷KI
28、4由重3 .中期检查记录通过科研训练，学生们熟悉了基本的细胞培养，药物处理，westernblot等基本技术，能够初步将细胞生物学的知识与课题相联系，并初步具有独立分析实验中遇到的实际问题的能力，同时也存在着许多不足，如无菌操作的不熟练等。指导教师评语指导教师（签字）：杜斌2021年11月23日意见建议:检查意见经专家组检查，同意口不同意该项目继续研究。专家组成员（签字）：年月日4 .结题验收记录研究成果1.项目成员（签字）：渠海陵郝奕楠刘航申冀2022年3月1日指导教师评语指导教师（签字）：杜斌2021年3月3日4.结题验收记录经费验收验收人（签字）：年月日检查意见评语:经专家组检查，同意不同意该项目结题。专家组成员（签字）:年月日
