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1、雷公藤甲素对大鼠脊髓损伤后自噬的影响及机制研究金哲I杨建文2罗春山21.贵州医科大学研究生院，贵州贵阳550000：2.贵州省骨科医院脊柱外科，贵州贵阳550002基金项目：贵州省卫生健康委科学技术基金项目(gzwjkj2019-l-135)通讯作者：罗春山,主任医师，E-mail:o摘要目的探讨雷公藤甲素对大鼠脊髓损伤(SCI)后自噬的影响及作用机制。方法将60只健康大鼠随机分为假手术组、模型组、雷公藤甲素组和阳性对照组，每组各15只。假手术组只进行椎板切除术，不损伤脊椎，其他3组按照Anens法制作SCl模型，雷公藤甲素组腹腔注射0.4mg(kg4)雷公藤甲素溶液，阳性对照组腹腔注射30m
2、g(kgBeclin1及凋亡相关蛋白BCl-2、Caspase-3的表达水平C结果假手术组、模型组、雷公藤甲素组和阳性对照组造模成功率分别为93.33%(14/15)、86.67%(13/15)、93.33%(14/15)、93.33%(1415)o模型组、阳性对照组、雷公藤甲素组术后各时间点BBB评分随时间延长升高(PVO.05)；术后模型组、阳性对照组、雷公藤甲素组BBB评分均低于假手术组(PV0.05)；术后阳性对照组、雷公藤甲素组BBB评分均高于模型组(PV0.05)；术后雷公藤甲素组BBB评分均低于阳性对照组(PV0.05)。术后7d假手术组大鼠未见明显组织学改变；模型组大鼠脊髓细胞
3、肿胀明显；阳性对照组、雷公藤甲素组大鼠损伤脊髓组织神经元损伤和水肿有所缓解。假手术组脊髓组织结构基本正常；模型组脊髓组织肿胀、空泡化十分明显，有大量自噬囊泡形成；阳性对照组存活的神经元胞核形态接近正常，自噬小体数量明显减少：雷公藤甲素组受损神经元细胞病理状态有所减轻，自噬小体数量有所减少。雷公藤甲素组、阳性对照组脊髓组织中LC3B蛋白表达水平高于假手术组、模型组(PVo.05)；模型组、雷公藤甲素组和阳性对照组凋亡相关蛋白BCI-2、CaSPaSe-3表达水平均高于假手术组(PV0.05)；雷公藤甲素和阳性对照组Bcl-2表达水平高于模型组，CaSPaSe-3表达水平低于模型组(PVO.05)
4、c结论雷公藤甲素可能通过上调细胞自噬、抑制细胞凋亡机制在一定程度上促进SCI大鼠运动功能恢复。关键词脊髓损伤；雷公藤甲素；自噬；运动功能Basso-Beattie-Bresnahan评分；LC3B蛋白StudyontheeffectoftriptolideonautophagyafterspinalcordinjuryinratsanditsmechanismJINZhe,YANGJian-wen2LUOChun-Shan2(GraduateSchoolofGuizhouMedicalUniversity,GuizhouProvincefGuiyang550000.China;SPinalSu
5、rgeryDepartment,GuizhouOrthopaedicHospitaLGuizhouProvince1Guiyang550002,China)AbstractObjectiveTbinvestigatetheeffectsandmechanismsofactionofrapamycinonautophagyafterspinalcordinjury(SCI)inrats.MethodsSixtyhealthyratswererandomlydividedintoasham-operatedgroup,amodelgroup,arennetgroupandapositivecont
6、rolgroup,with15ratsineachgroup.Inthesham-operatedgroup,onlyIaminectomywasperformedwithoutinjurytothespine,andintheotherthreegroups,SCImodelsweremadeaccordingtoAllensmethod.0.4mg(kg-d)ofFaphenmetrazinesolutionwasadministeredintraperitoneallytotheraphenmetrazinegroup,30mg(kg-d)ofmethylprednisolonesolu
7、tionwasadministeredintraperitoneallytothepositivecontrolgroup,and3mL(kg-d)of5%dimethylsulfoxide-salinesolutionwasadministeredintraperitoneallytothesham-operatedandmodelgroupsfor7d.Themotorfunction(BBB)scoresoffourgroupsofratswereevaluatedbefore,12h,1d,3d,and7daftersurgery.Histopathologicalchangesint
8、hespinalcordofratswereobservedbyhematoxylin-eosin(HE)stainingaftertakingsectionsoftheinjuredspinalcordat7dpostoperatively,andtheautophagicstructuresofratspinalcordneuronswereobservedbytransmissionelectronmicroscopy,andtheexpressionlevelsofautophagy-relatedproteinsLC3B,Beclin1andapoptosis-relatedprot
9、einsBcl-2andCaspase-3inratspinalcordtissuesweredetectedbyWesternblot.ResultsThemodelingsuccessrateswere93.33%(14/15),86.67%(13/15),93.33%(14/15),and93.33%(14/15)forthesham-operatedgroup,themodelgroup,therapamycingroup,andthepositivecontrolgroup,respectively.BBBscoresincreasedwithtimeateachpostoperat
10、ivetimepointinthemodelgroup,positivecontrolgroup,andtretinoingroup(P0.05).PostoperativeBBBscoreswerelowerinthemodelgroup,positivecontrolgroup,andregalcitoningroupthaninthesham-operatedgroup(P0,05),PostoperativeBBBscoreswerehigherinthepositivecontrolgroupandtheregimenmethylenegroupthaninthemodelgroup
11、(尸0.05).PostoperativeBBBscoreswerelowerinboththeregimenmethylenegroupthaninthepositivecontrolgroup(P0.05).Noobvioushistologicalchangeswereobsen,edinthesham-operatedratsat7daftersurgery,thespinalcordcellsinthemodelgroupwereobviouslyswollen,theneuronaldamageandedemaintheinjuredspinalcordtissuesofthera
12、tsinthepositivecontrolgroupandtherhodopsingroupwererelieved.Thespinalcordtissuestructureofthesham-operatedgroupwasbasicallynormal,theswellingandvacuolizationofthespinalcordtissueofthemodelgroupwereveryobvious,andalargenumberofautophagicvesicleswereformed,thenucleusmorphologyofthesurvivingneuronsofth
13、epositivecontrolgroupwasclosetonormal,andthenumberofautophagicvesicleswassignificantlyreduced,thepathologicalstateofthedamagedneuronalcellsoftheratsintherhodopsingroupwasreduced,andthenumberofautophagicvesicleswasreduced.TheexpressionlevelofLC3Bproteininspinalcordtissueswashigherintheraffinosemethyl
14、enegroupandpositivecontrolgroupthaninthesham-operatedgroupandmodelgroup(P0,05),theexpressionlevelsofapoptosis-relatedproteinsBcl-2andCaspase-3werehigherinthemodelgroup,rakuganetingroupandpositivecontrolgroupthaninthesham-operatedgroup(P0.05),theexpressionlevelsofBcl-2werehigherintherakuganetinandpos
15、itivecontrolgroupsthaninthemodelgroup,andtheexpressionlevelsofCaspase-3werelowerthaninthemodelgroup.TheexpressionlevelsofCaspase-3werelowerthanthoseofthemodelgroup(PBCl-2、Caspase-3GAPDHDylight649山羊抗兔IgG抗体、山羊抗兔/抗小鼠IgG抗体购于英国Abcam公司，BCA试剂盒及RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂购于上海阿拉丁生物化学技术公司，Tanon5200全自动化学发光图像分析系统、EPS
16、-600数显式稳压稳流电泳仪购于上海天能科技有限公司，AvantiJXN-30/26智能型高效禽心机购于美国贝克曼库尔特公司，JEOLJEM-2800高通量场发射透射电子显微镜购于日本电子株式会社。1.2 方法1.2.1 实验大鼠分组将60只大鼠按体质量随机抽样的方式分为假手术组、模型组、雷公藤甲素组和阳性对照组，每组各15只。1.2.2 大鼠SCI模型制备术前用高压蒸汽灭菌法对手术所使用的全部器械进行消毒，大鼠称重后用体积分数3%戊巴比妥钠（30mgkg）腹腔注射麻醉，用卵圆钳钳夹四肢无反应后取俯卧位固定在操作台上，在胸腹部垫软垫使胸椎向后突出明显，剔除大鼠胸背部毛发，碘伏消毒，铺无菌洞巾，
17、利用肋骨进行定位取2段背部正中做长约30mm切口，切开皮下组织，逐层分离至椎板，慢慢咬除椎板后（注意不要戳破大鼠硬脊膜，确保硬脊膜完整无损）暴露出脊髓（长约6mm）,以自制脊髓打击器击打脊髓，撞击后见大鼠脊髓充血水肿，双下肢及尾巴抽搐摆动，制造SCl模型成功。充分止血后逐层缝合肌肉、皮肤并消毒。以上操作均在体视显微镜下进行。假手术组只进行椎板切除，不损伤脊髓，术后放回屏障系统内饲养。其他3组大鼠术后每8h人工挤压下腹部按摩膀胱进行人工排尿排便，直至恢复自主排尿排便功能，术后3d均给予青霉素100U(g-d)腹腔注射防止感染。1.2.3 各组大鼠给药方式假手术组和模型组术后分别腹腔注射相同剂量3
18、mL(kg-d)的5%二甲基亚飒-生理盐水溶液，雷公藤甲素组给予腹腔注射剂量为0.4mg(kgd)的雷公藤甲素溶液，阳性对照组术后给予腹腔注射剂量为30mg(kg-d)的甲基强的松龙溶液叫均连续给药7d。1.2.4 大鼠运动功能评分分别评估大鼠术前、术后12h、1d、3d、7d的运动功能(BassoBeattieBresnahan,BBB)评分：在同一时间段，把大鼠放置在平台上，采用双人观察并记录其行走情况及后肢活动情况，包括大鼠后肢关节活动情况、大鼠后肢协调功能及步态、大鼠活动时爪的精细动作，共21分，得分越高表示大鼠肢体活动能力越强。1.2.5 大鼠脊髓组织苏木精.伊红染色在术后第7d使用
19、10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉成功后颈部脱位处死大鼠，沿原后背切口切开，分离伤处脊髓段上方软组织，将伤段脊髓完整暴露出来，准确定位目标脊髓段，取出约1.5Cm长的脊髓组织，使用40gL的多聚甲醛固定24h,石蜡包埋，常规脱蜡、水化和水洗等操作后，取5m厚矢状切片用苏木精染色6min,然后浸入1%酸性乙醇中5s,用双蒸水冲洗切片IOmin,接着用0.5%伊红溶液染色5min,梯度脱水将得到的切片分别置入二甲苯I、11溶液各IOmin透明，取出后用中性树脂封闭，最后在光学显微镜下观察并记录病理学变化。1.2.6 透射电镜观察大鼠脊髓神经元自噬体将上述经石蜡包埋、脱蜡、水化和水洗后的脊髓修剪成
20、体积约ICm3,在戊二醛中固定4h,取出置于PBS缓冲液中进行漂洗，再置入1%锹酸-105%亚铁鼠化钾溶液中进行固定2h,再次使用PBS缓冲液进行漂洗20min,之后进行梯度脱水，置于由包埋剂和环氯丙烷配制(3:1)的渗透剂中30min,再放入纯环氧树脂中3h,取出放入含有包埋剂的多孔橡胶板中，填充纯环氧树脂，再放入40烤箱烤12h,60C烤48h,取出后进行切片，置于铜网上，覆盖于醋酸铀染剂上，接触20min,蒸锵水冲洗切片，吸干水分，再将铜网覆盖于柠檬酸铅染剂上8min,蒸镭水冲洗切片，吸干水分，置于日立7700型透射电镜下观察并摄片。1.2.7 WeStenlbIOt检测大鼠脊髓组织中自
21、噬相关蛋白及凋亡相关蛋白表达称取100mg取出的新鲜脊髓组织，剪碎后加入ImL细胞裂解液(含1%蛋白酶抑制剂、1%磷酸酶抑制剂)，12000rmin离心IOmir),取上清液，提取总蛋白，冻存备用，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将各组蛋白浓度稀释至2gL,按比例加入蛋白上样缓冲液，充分混匀后IO(TC水浴加热10min使蛋白质变性，等量蛋白样本上样量经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOdiUmdodeCyISUIfate-PolyaCrylamidegeleleCtroPhOresis,SDS-PAGE)分离后，蛋白转移至聚偏氨乙烯（PoIyVinylidenefIUori
22、de,PVDF）膜上，转膜为恒流300mA,时间为70min。5%脱脂奶粉封闭60min,TBST（20mmolL）洗涤5次,5min次,分别加入LC3B（1：I000）、Beclin1（1：1000）,Bcl-2一抗（1:500）,Caspase3（1：1000）,室温振荡孵育2h,加酶标记二抗（山羊抗兔/抗小鼠IgG抗体，1：5000）,室温振荡孵育1h,使用TBST（20mmolL,Tris-HCl,pH7.6,137mmol/LNaCl,0.1%Tween-20）洗涤3次，10min次，膜表面滴加超敏ECL（Electro-Chemi-Luminescence）反应液后用Bio-Rad
23、化学发光成像仪采集图像，X射线片用CheniImager5500V2.03软件扫描，并使用ImageJ软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白表达量。1.3 统计学方法采用SPSS26.0软件分析处理数据，计量数据以均数土标准差（Ms）表示，重复计量资料比较采用重复测量方差分析，两两比较采用LSDd检验。PV0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 各组造模成功率假手术组中1只大鼠出现死亡，造模成功率为93.33%（14/15）,模型组中1只大鼠出现死亡，1只术后未瘫痪，造模成功率为86.67%（13/15）,雷公藤甲素组和阳性对照组各有1只大鼠术后
24、未出现瘫痪造模成功率均为93.33%（14/15）,后期均予以相应的补充，使除假手术组外，其余3组每组15只大鼠术后均呈瘫痪状态（即双后肢表现为无力，拖地行走）。2.2 各组不同时间点BBB评分假手术组大鼠术后各时间点BBB评分无统计学差异（P0.05）；模型组、阳性对照组、雷公藤甲素组术后各时间点BBB评分随时间延长升高（P0.05）；术后模型组、阳性对照组、雷公藤甲素组BBB评分均低于假手术组（PV0.05）；术后阳性对照组、雷公藤甲素组BBB评分均高于模型组（PV0.05）；术后雷公藤甲素组BBB评分均低于阳性对照组（尸0.05）。见表1。表1各组不同时间点BBB评分（分，xs）时间假手
25、术组（w=l5）模型组（=15）阳性对照组（=15）雷公藤甲素组(w=15)尸值P值产值19.860.000.001435.68术后12h2.030.00a0.00a0.000.00a1435.6800.0010术后Id20.020.002.262.01+1235.2390.0011235.232.030.00a0.25ab0.23abc921.00+0.364.643.26士13464.0313464.0术后3d0.000.05a0.5Iab0.35abc00.0013021.001.235.955.077366.62术后7d0.000.14a0.63ab0.52abc7366.6210.0
26、01159.743Fntm/P值0.00132.359/姐间/P值0.001Fw(ja(i18.725/V/P值0.001注：与假手术组比较，aP0.05;与模型组比较，bP005）;雷公藤甲素组、阳性对照组LC3B蛋白表达水平无明显差异（P0.05）;假手术组、模型组、雷公藤甲素组和阳性对照组BeClin-I表达水平无明显差异（P005）;模型组、雷公藤甲素组和阳性对照组凋亡相关蛋白BCl-2、CaSPaSe-3表达水平均高于假手术组（PV0.05）；雷公藤甲素和阳性对照组Bcl-2表达水平高于模型组，Caspase-3表达水平低于模型组（PVO.05）；雷公藤甲素组与阳性对照组Bcl-2C
27、aspase-3表达水平无明显差异（P0.05）见图3、图4。假手术组 模型的阳性对熙世芸公育甲素殂图3各组大鼠脊髓组织中自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白表达情况各组大鼠脊髓组织蛋白相对表达量Beclin-I Bcl-2 Caspase-3口假手术组0模型组 副阳性对照组N雷公藤甲素组图4各组大鼠损伤脊髓组织蛋白相对表达量（与假手术组比较，ap0.05;与模型组比较，bP0.05）3讨论SCl是一种创伤性疾病，发病率呈逐年上升趋势，其引发的继发性损伤会造成以脊髓灰质为中心的区域出现神经元大量死亡，启动机体的免疫炎症反应，产生炎性细胞因子和化学趋化因子，通过受损的脊髓血脑屏障与外周循环中的淋巴细胞、中
28、性粒细胞及巨噬细胞相结合，进一步造成神经细胞的坏死和凋亡，从而导致病情加重。因此，保护受损神经元、减轻SCI诱导的继发性损伤及促进神经轴突的再生是治疗SCI的主要策略。SCl的主要临床症状是运动功能障碍。本研究结果显示，术后7d雷公藤甲素组、阳性对照组大鼠BBB评分均有所提高，但雷公藤甲素组稍低于阳性对照组，这与马斌详等的问研究结果基本一致，说明雷公藤甲素可在一定程度上恢复SCI大鼠运动功能。雷公藤甲素是一种活性单体成分，具有抗炎、抗肿瘤和免疫功能调节作用，在多种疾病中均发挥出良好治疗作用。在SCl大鼠模型中，雷公藤甲素可通过上调miR-96表达，降低小胶质细胞活化标志物Iba-I和IKKNF
29、-B相关蛋白，抑制BV2细胞中小胶质细胞的活化和炎性细胞因子的分泌，改善神经行为并减少星形胶质细胞胶质增生和神经胶质瘢痕，从而促进SCI大鼠的轴突再生和运动恢复I川。本研究病理学结果显示，阳性对照组、雷公藤甲素组损伤脊髓组织神经元损伤和水肿有所缓解，区域结构相对改善，说明雷公藤甲素对SCI大鼠的脊髓神经元损伤具有保护作用。Pan等研究显示，不同浓度的雷公藤甲素组大鼠脑水肿、脑梗死体积、神经功能及氧化应激指标改善程度均显著优于模型组，认为雷公藤甲素通过介导激活Wnt-catenin信号通路发挥脑保护作用。但有关SCI模型中雷公藤甲素具体的作用分子机制仍有待进一步探讨。自噬是细胞内容物以及自身退化
30、的细胞器被溶酶体降解的过程,细胞首先通过双层膜包裹待降解物质形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在溶酶体内多种酶的消化作用下降解其所包裹的内容物，借此实现细胞本身的代谢需要以及细胞器的更新，维持自身稳态I。最新研究表明E雷公藤甲素是一种有效的自噬诱导剂，可以在多种细胞系中通过多种机制调控自噬水平,但神经元内的自噬调控机制有别于其他细胞,活性更高调控更加复杂。本研究透射电镜图显示，模型组神经元胞核形态异常，有较多自噬小体形成，而阳性对照组存活的神经元胞核形态接近正常，自噬小体数量明显减少，雷公藤甲素组受损神经元细胞病理状态有所减轻，自噬小体数量少于模型组，但多于阳性对照组，从细胞形态学的
31、角度反映Sel发生后神经元细胞自噬增强，与Rong等网研究结果相符，说明自噬参与大鼠Sel病理过程。此外，本研究结果显示，雷公藤甲素组、阳性对照组LC3B蛋白表达水平高于假手术组、模型组，雷公藤甲素组、阳性对照组LC3B蛋白表达水平无明显差异，4组BeCIin-I表达水平无明显差异，说明雷公藤甲素诱导细胞自噬产生。正常情况下，机体自噬处于低表达水平,维持细胞稳态,但当机体受到外界有害刺激时会表达上调，以此清除细胞内有害成分，提高细胞对外界刺激的耐受1网。LC3B为自噬相关蛋白，参与自噬体的形成，其定位于前自噬泡和自噬泡膜的表面，是自噬泡膜的通用标记物，其表达量的高低反映细胞的自噬活动强弱2LB
32、edin-I参与自噬前体结构形成，其复合物可促进自噬泡的形成】。SCI发生后自噬的过度表达可能会引起神经细胞凋亡，自噬和凋亡之间可能存在功能上的某种联系侬】。BCI-2、CaSPaSe-3是细胞凋亡途径中的关键蛋白质，其中Bcl-2具有抗细胞凋亡作用，而CaSPaSe-3参与诱导和介导细胞凋亡3-2久本研究结果显示，雷公藤甲素和阳性对照组Bcl-2表达水平高于模型组，Caspase-3表达水平低于模型组，雷公藤甲素组与阳性对照组BeI-2、CaSPaSe-3表达水平无明显差异，提示雷公藤甲素可在一定程度上抑制神经细胞凋亡。可能是因为激活自噬可保护神经元、减少丢失，清除细胞内受损线粒体来延迟细胞
33、凋亡或抑制细胞凋亡，促进神经功能的恢复，而抑制自噬则会加剧神经元的凋亡，引起大鼠神经变性BL但目前自噬与细胞凋亡之间的具体关系机制还未完全清楚，尚需深入研究。综上所述，雷公藤甲素可在一定程度上恢复SCI大鼠运动功能，其作用机制可能是通过上调自噬、抑制神经细胞凋亡实现的。但本研究观察时间有限，未对雷公藤甲素的远期效果进行观察，后续需延长观察时间进一步探讨其作用机制。参考文献3 EckertMJ,MartinMJ.Trauma:spinalcordinjuryJ.SurgClinNorthAm,2017,97(5):1031-1045.2AhujaCS,NoriS,TetreaultL,etal.
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