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1、2023肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药机制的研究进展近年来，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌临床分离率不断增加，导致多黏菌素成为治疗多重耐药肺炎克雷伯菌感染的重要防线，但随着多黏菌素的使用增多，其耐药率也逐渐升高。肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药机制多种多样，以外膜修饰脂多糖为主。参与这一过程的基因除位于染色体上的双组份系统夕万。2、PmrAB、b18及负性调控跨膜蛋白77gM基因外，质粒携带的移动性多黏菌素耐药基因力”也能介导外膜修饰。其中，mg加基因变异对多黏菌素耐药起关键作用。本文主要阐述肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药机制，以更好遏制肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药发生。肺炎克雷伯菌属肠杆菌目，在人类细菌性感染的病原体中居
2、于前3位【1】。中国细菌耐药监测网显示2022年112月临床分离株中肺炎克雷伯菌对美罗培南及亚胺培南耐药率分别为24.2%和22.6%碳青霉炸酶，如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KlebsiellapneumoniaeCarbapenemase,KPC)、新德里金属B内酰胺酶(NewDelhimetallo-lactamase,NDM)、OXA-48等播散使得碳青霉焙类抗菌药物无法用于治疗碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CarbapenemresistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)o新型B内酰胺类抑制剂的抗菌药物如头抱他D定/阿维巴坦对于产NDM的CRKP无效,产KPC-2的
3、CRKP感染在使用头抱他咤/阿维巴坦治疗的过程中可因KPC-2变异致治疗失败，多黏菌素可作为治疗CRKP的最后手段【2】,但随着多黏菌素在临床使用增加,耐药率明显升高【21。2019年一项较为全面的数据统计发现，临床分离肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药率分别为4.0%（亚洲）、3.5%（南美洲）、3.2%（欧洲）、2.4%（非洲）、0.8%（北美洲）。其中，亚洲较20142018年有明显的增长趋势3。中国细菌耐药监测网2022年112月数据显示临床分离肺炎克雷伯菌对黏菌素和多黏菌素B的耐药率分别为2.8%和4.8%,其中难治型耐药肺炎克雷伯菌对黏菌素和多黏菌素B的耐药率分别为8.1%和5.9%0一.多
4、黏菌素抗菌机制多黏菌素主要通过诱导细菌细胞膜损伤发挥杀菌作用。MUlarSki等4将肺炎克雷伯菌暴露于一定浓度的多黏菌素后，电镜下观察到，在细菌接触到多黏菌素后，细胞壁表面出现大量突起，部分细胞内容物通过裂隙释放，细胞膜也随即裂解，内容物漏出，细菌死亡。目前，多黏菌素抗菌机制还未完全明确。已知的抗菌机制包括以下3种：自促摄取机制、内膜囊泡和外膜囊泡接触机制以及羟基自由基释放诱导机制。以上3种抗菌机制通过不同的方式诱导细胞膜损伤发挥杀菌作用，具体如下：肺炎克雷伯菌表面的脂多糖结构是多黏菌素的主要及起始作用靶点，由3部分组成：脂质A、核心多糖和。-抗原。多黏菌素的二氨基丁酸残基带正电5。无外界干扰
5、时，脂质A与二价阳离子Ca2+和Mg2+结合，维持膜结构稳定性。多黏菌素进入人体后，二氨基丁酸残基在静电作用下与细菌表面带负电的脂质A上的磷酸基团相互结合，破坏细胞结构的稳定性，膜的通透性增加，导致细菌裂解死亡，该机制被称作自促摄取机制，为多黏菌素主要抗菌机制5】。多黏菌素进入细胞周质中可以促进内膜囊泡和外膜囊泡的形成，囊泡之间接触后发生磷脂交换，破坏膜结构及稳定性从而发挥杀菌作用，该机制可称作囊泡接触机制【6】。此外，多黏菌素还可以通过释放羟基自由基浓度依赖性的抑制细菌内膜中的关键呼吸酶，从而破坏细胞膜及其他成分的结构和稳定性，发挥杀菌作用，即多黏菌素羟基自由基释放诱导机制7。二.多黏菌素耐
6、药机制目前研究显示肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药机制包括外膜修饰脂多糖8、荚膜多糖生成增加9、外排泵过表达口。其中，外膜修饰脂多糖是多黏菌素耐药的主要机制8,参与基因主要有pmrAB.PhoPQ、08双组份系统(twocomponentsystem,TCS)以及负反馈调节基因mgrBo止匕外，多黏菌素耐药性可通过质粒携带的可编码磷酸乙醇胺转移酶的移动性多黏菌素耐药基因(mobilecolistinresistance,mcr)进行水平传播口】。(一)外膜修饰脂多糖介导多黏菌素耐药机制脂多糖脂质A上带负电荷的磷酸基团被化学基团修饰后，多黏菌素失去作用靶点，无法发挥杀菌作用，这是外膜修饰介导多黏菌素耐药
7、的主要机制8。研究显示修饰脂多糖的成分主要是4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖和磷酸乙醇胺。这一修饰过程在多种基因参与下完成，具体过程见图K介导外膜修饰的耐药基因主要包括染色体编码的双组份系!统PmrAB、PhOPQ、errAB负性调控跨膜蛋白少/夕和质粒编码的mcro其中，MgrB蛋白失活是肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药的主要原因12,13,14,15,16,17。1:HA力*f乙两引4N4-WHRML-REtlBEr力修动仕多!时？5因Pho笛PmrAB.GrAB力二1室.冬JBil.PrrrD.CCi三三,而公性=fe*XTEFRlStMb子刖6WpW料子.在=妁4块分KEAmY攵标5匕下转修更
8、aBw!W三三;偿三K三37和汐加A2J（力加1/田任杂皓*现3火田.刖r*JM*x子安feVT.r5*AMYHFzMMmCXJWA?.AyA或一血爱事5所8委的0*PmrAB初的觐喊逐丘夫.CncB-梅GrABimAKgfi号常HIC,替中83吐#09汕反IwHfHOWPEoQ*CJaiFFh5QTCSaRMW.3EIa/多叱修访。程.4可三L11v共矢前.此外,Ed!：Wfl国R3A3d外,缶在国图1外膜修饰介导的肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药机制MpmrABTCS:在肺炎克雷伯菌中，夕”!通常编码223个氨基酸，加工形成调节蛋白PmrA;夕加由通常编码546个氨基酸,加工形成细胞膜结合传感激酶
9、PmrBop7745TCS是调节多黏菌素耐药的核心通路，夕/7。PQ和CrrABJCS均可通过该通路介导脂多糖的修饰，但是在肺炎克雷伯菌的多黏菌素耐药机制中IPmrABTCS的变异并不占主导地位18,19。YUSof等【18纳入来自意大利、印度、韩国、中国等国家共计1215株多黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌(20062020年)，发现PmrB蛋白失活在多黏菌素耐药机制中占54%,仅次于MgrB失活(88%)2. PhoPQlCS在肺炎克雷伯菌中点力”编码223个氨基酸,phoQ编码488个氨基酸。PhoPQ除通过PmrD间接作用于夕TWr和PmrHFIJKLM基因的启动子外，还可以越过PmrD直接作
10、用于夕/77日依例介导多黏菌素耐药【2。】。PhoP和PhoQ的突变类型主要为点突变和缺失突变18。PhoPQlCS在肺炎克雷伯菌中的变异率仅次于mg由和PmI8基因【1a19L3. 及其启动子共计266bp,其中启动子122bp,mgrB基因144bp,编码47个氨基酸，最终加工形成的跨膜蛋白MgrB能够抑制PhoP蛋白磷酸化，阻止PhOPQTCS下游通路的激活。MgrB蛋白失活IPhoPQ负反馈通路被阻断,下游通路激活，致脂多糖修饰及多黏菌素耐药。MgrB蛋白的突变类型丰富，包括终止突变，错义突变，单个氨基酸的缺失突变,部分或完整mg所缺失和插入突变等【20】。mg由基因突变是肺炎克雷伯菌
11、多黏菌素耐药的主要原因，突变位点几乎可以发生在该基因的任何位点，突变频率有高有低。其中，插入序列(insertionsequenceJS膈入突变更为常见11213*14，22,23LIS是结构简单的移动元件，广泛分布于原核细胞的染色体和质粒上，携带12个转座酶(tnp)基因，依赖转座酶的活性发生转座。IS转座可介导基因重排与基因组多样性，在转座重排的过程中也会插入到一些耐药基因中。IS两端的直接重复序列(directrepeats,DR)是转座到目标基因后由自身编码的转座酶介导合成的，但是并不是所有IS在转座到靶点后均会合成DRo在众多的多黏菌素耐药相关基因中,IS几乎只插入小基因24,且几乎
12、所有插入在mgrB中的IS两端均编码DR,所编码的DR是加夕B自身的基因片段，810bp不等。IS几乎可以插入在mg4基因的各个位点，频率不一，+69+76可能是热点，见表1。=T-iH一一M二一.a-33*7II3J(ZUM)nj49M48H(MI1l(W(M)119MAcHtrn。c*mut*errmg4插入突变的频率居高不下，近年来，有不少学者将其归因于质粒传播12,17,25,26,即强力基因中插入的IS更倾向于来自质粒,尤其是接合型质粒，在多黏菌素或其他抗菌药物刺激下，携带的IS活性增加，转座到染色体上的mgrB中,介导多黏菌素耐药性的发生甚至传播17L如，Cienfuegos-Ga
13、llet等27描述了jgrB因SKp25插入失活的对碳青霉烯和多黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌在医院出现克隆传播的现象，并发现这些IS小都位于pKpQIL质粒上。进一步进行流行病学调查显示这种携带IS的。25的质粒在携带KPC的CRKP中广泛存在【I。Zhang等125在临床上分离了1株mgrB因SKpn72插入突变导致多黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌，该菌IS小存在于染色体与质粒上,但质粒上的IS的转座到mgrB基因中的频率更高,且两端没有DR的IS机Z?转座到也用基因的频率也更高。该质粒携带IS小的同时还携带KPCz并且经接合实验证实具有接合性。进一步验证了IS可能会引起多黏菌素耐药性水平传播的假说。
14、与6介导的多黏菌素耐药性不同,质粒携带的IS若整合到染色体耐药基因上往往变得更加稳定。插入在ZngM基因中的IS类型多种多样，目前发现的有IS5-like.ISKpn74.SKp26.ISKPn25、IS9038最为常见【。针对核血基因中的IS是否更倾向于来源于质粒这一问题，Fordham等【”在2022年进行了的较为全面的分析携带ISKPn26、ISKPn14、ISKPn25或E903B的质粒中，分别有82.5%、75%、57.5%和12.5%的比例同时携带碳青霉烯酶。上述研究提示学者在今后的研究中应该重视ng8基因中IS的来源，若这些引起力基因插入突变的IS真的来自质粒，甚至接合性质粒，那
15、么未来治疗多重耐药肺炎克雷伯菌将迎来巨大挑战。4. CrrABJdS:在肺炎克雷伯菌中，。川8双组份系统也参与多黏菌素耐药。ClTA编码234个氨基酸，”由编码353个氨基酸。CrrA蛋白在CrrB的作用下活化,随之作用于CrrC蛋白后者再作用于PmrA蛋白，下游通路依次激活，最终引起脂多糖修饰【29】。McConviIIe等2。研究显示，CrrA可以越过CrrC直接作用在PmrHFLIKLM蜃作子上。关于CrrABlGS变异引起的多黏菌素MlC值的变化也做过相关研究。该研究对和强力进行基因编辑得出结论，CrrB蛋白87、94、151位点发生点突变(256mg/L)时，其多黏菌素MIC值明显高
16、于69所失活(32mg/L)时2。CrrB和MgrB蛋白同时突变时多黏菌素MlC值具有叠加效应(2048mg/L)20。其他位点突变引起多黏菌素MIC值的变化有待进一步研究。关于crrAB突变引起的多黏菌素耐药性高于其他基因(如mgrB、PhOPQ、PmrAB)这一问题，Cheng等【3。】采用基因编辑技术作出相关解释：CrrB蛋白失活(N141I)不仅介导脂多糖修饰，还能够通过激活uU基因启动子促进/T下游的外排泵转运蛋白H239_3064表达，从而产生协同效应，表现出较高的MlC值(2048mg/L)。CrrABlGS不仅通过调控T实现脂多糖修饰，可能同时调控其他可引起多黏菌素耐药的基因，
17、这一点有待进一步探索。5. 质粒携带自2015年发现多黏菌素耐药性可以通过质粒携带的6基因进行传播，多黏菌素耐药机制的研究进入了一个新领域，先后在70多个国家都有6门阳性菌株的报道31。6基因编码的蛋白为eptA,负责将脂多糖修饰物PEtN转移到脂质A的磷酸基团上介导多黏菌素耐药。在人体的携带率远低于动物，主要分布于肠杆菌目，以大肠埃希菌最为多见,肺炎克雷伯菌和沙门菌次之口1】。临床分离株肺炎克雷伯菌mcr基因的携带率明显低于大肠埃希菌32,33,34o有研究收集血流感染的患者的1495株大肠埃希菌和571株肺炎克雷伯菌，肺炎克雷伯菌”携带率仅0.2%(1/571),低于大肠埃希菌(1%,20
18、/1495)33。Zheng等【35】收集了979株临床分离的肺炎克雷伯菌,其中“阳性的菌株仅2株(0.2%,2/979)迄今为止发现的6基因共计10种(mcr1-mcr1O)进化关系见图2o携带用e的质粒多种多样，以Ind2、InCX4、InCX2、InCP及Indl较为常见32Trwscale:0.1aYae-三r*24L-*r-9Hicr-IO222Ilncr-3注：g7WS(三因字?;央白Genebank,所对应的ACCeSsion号依次为NG5(M17.1.IT598652.1.LC548747.1.MF543359.1.KY0O7921.1.MF176240.1.MG267386.
19、MG736312.MK791138.1.MN179W.1.-EMEGAH!iggWK(T0LK4*JH).不同Bte用于区分遇化关至图26=7-670核甘酸序列进化关系6基因因变异发生失活的比例较低。目前发现的有3种，包括自身序列(22bp)重复失活(宋内志贺菌，越南)、IS7294b插入失活(大肠埃希菌，中国)以及IS70”大肠埃希菌，荷兰)插入失活35。经体外诱导实验证实前2种细菌在多黏菌素的诱导下会失去其中的重复序列或插入序列，从而恢复到正常结构发挥作用并且可以发生水平转移。（二）肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药其他机制除外膜修饰外，荚膜多糖、外排泵也参与多黏菌素耐药。荚膜多糖在多黏菌素和肺炎克
20、雷伯菌相结合的过程中起到屏障作用。Campos等9通过实验研究发现,在多黏菌素B的作用下，肺炎克雷伯菌生成的荚膜多糖增加，且进一步分析基因表达量发现多黏菌素B能够显著增加3S基因的表达量。同时，当通过基因编辑的方法消除肺炎克雷伯菌的荚膜多糖的生成后，其细胞膜表面能够黏附更多的多黏菌素B,细菌存活率明显下降。FOrmoSa等136研究显示,与多黏菌素敏感的肺炎克雷伯菌相比，多黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖结构更厚且坚固,并推测这一现象与mgM失活可能有一定的关联。外排泵引起的肺炎克雷伯菌对多黏菌素耐药较为少见，目前发现的介导肺炎克雷伯菌对多黏菌素耐药的外排泵主要是AcrAB-ToIC（il实
21、验证明肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药性可被外排泵抑制剂氧化物-3-氯苯腺抑制或逆转37）。三.多黏菌素异质性耐药近年来，不少研究显示肺炎克雷伯菌多黏菌素异质性耐药率要高于多黏菌素耐药率138,39o目前还没有精确的定义来概括所出现的异质性耐药现象。广义上讲，抗菌药物异质耐药性是指采用传统的微量肉汤稀释法确定的对某抗菌药物敏感的菌株，进一步用异质性耐药检测金标准菌落谱型分析法(populationanalysisprofile,PAP)鉴定发现，与主要群体相比，有一个或多个亚群对该抗菌药物显示耐药。在一些因素作用下，如抗菌药物的压力下，该亚群可不断增殖，逐渐过渡成完全耐药的菌株。异质性耐药更侧重于
22、强调细菌发展为耐药的中间过程。MeIetiS等39在希腊某三甲医院纳入20株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌发现其异质性耐药率高达60.0%(12/20),并且11/12株的异质性耐药性经过连续传代14d可稳定存在。Poudyal等38收集了22株来自澳大利亚、亚太、法国等国家多重耐药肺炎克雷伯菌,研究发现其中有6株对多黏菌素耐药(6/22,22.27%),有15株对多黏菌素异质性耐药(15/22,68.18%)。目前关于肺炎克雷伯菌多黏菌素异质性耐药的机制研究还没有明确定论。Bardet等14。】在人的粪便中分离到了1株对多黏菌素异质性耐药的肺炎克雷伯菌，对其机制进行研究发现，该菌株对多黏菌素的异
23、质性耐药可能是由ZngM基因的38位点插入了一个G碱基，使得MgrB蛋白编码过程中终止突变引起的。Jayol等1m在1株携带OXA-48的肺炎克雷伯菌中发现PhoP蛋白Aspl91Tyr替换引起多黏菌素异质性耐药的现象。Halaby等142在临床中分离了5株来自不同患者的对多黏菌素异质性耐药的肺炎克雷伯菌，经分析发现这5株菌的异质性耐药机制各不相同分别由78基因机,74插入、mg4基因及其周围环境(4200bp)缺失，yciM蛋白V43G替换，PhoQ蛋白A21S替换，IpxM蛋白V30G替换。菌株所表现出的异质性耐药现象是菌株过渡为彻底耐药的中间过程还是瞬时过程及其中的分子生物学机制有待进一步研究。.总结与展望临床医生在使用多黏菌素治疗CRKP引起的感染时困难重重，明确多黏菌素耐药机制至关重要。介导肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药的主要原因是外膜修饰脂多糖致多黏菌素黏附性下降。mgrB插入突变是多黏菌素治疗过程中产生耐药机制的重要原因，其中IS转座到mgrB基因上导致MgrB失活占主导地位。IS广泛分布于细菌基因组的染色体及质粒中，若夕所中的IS主要来自于质粒，将水平转移引起播散。此外，在运用多黏菌素治疗时也应注意异质性耐药的问题。
