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1、最新：珍珠层成骨活性物质的研究进展骨质疏松症是骨代谢异常导致的骨量减少及骨微结构改变，骨脆性增加，可继发骨折损伤的一类全身性骨病。据2018年我国骨质疏松症流行病学调查结果，骨质疏松症已成为我国50岁以上人群的重要健康问题,50岁以上人群患病率达19.2%,65岁以上人群患病率高达32.0%印。骨质疏松症可导致骨折的发生，骨折后往往需要长期愈合，带来的长期疼痛、生活质量下降及经济负担等难以承受2。目前治疗骨质疏松症的药物包括骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和双重作用药物引。骨吸收抑制剂包括双麟酸盐、雌激素、选择性雌激素受体调节剂和降钙素等，骨形成促进剂包括特立帕肽、阿巴洛帕肽等以及双重作用药物罗莫单
2、抗。但以上药物批准治疗疗程较短，存在颌骨骨坏死、骨肉瘤、静脉栓塞等风险4。因此，寻找更多有效且安全治疗骨质疏松症的药物是目前的研究方向之一。研究表明珍珠层含有成骨活性物质，对骨形成起积极作用5。本文对珍珠层活性成分的提取、成骨作用研究进展进行综述，以期为今后珍珠层活性物质应用于骨质疏松症提供思路。1珍珠层活性物质的特点珍珠层是由95%的碳酸钙文石与5%的有机基质通过亚微米/纳米砖墙堆叠结构组成6。珍珠层有机基质的组成包括蛋白质、多糖、脂质等，其结构由几丁质核和附着于两侧的蛋白质层组成，位于碳酸钙文石层之间。虽然在珍珠层中有机基质只占5%,但它是碳酸钙晶体形成的框架,被认为是珍珠层形成的重要调控
3、成分8。珍珠层与天然骨组织类似，两者均是生物矿化的产物。虽然两者成分不同(骨组织主要由磷酸钙或羟基磷灰石构成)，但指导两者形成复杂的有机/无机纳米结构的部分很可能是同源的，其有机基质对骨形成同样具有促进作用9-10。2珍珠层活性物质的获取2.1 珍珠层脂质的获取脂质不具备水溶性，它的提取主要靠乙醛、氯仿等非极性有机溶剂。脂质通过使用含0.01%丁基羟基甲苯作为抗氧化剂的氯仿-甲醇(2：1,vv)混合溶剂提取。在得到珍珠层粉剂后，将粉剂与上述有机混合溶剂充分混合、离心，提取液在持续的氮气下干燥，获得的粉末即是目标脂质混合物口1。2.2 珍珠层蛋白质的获取珍珠层基质蛋白通常被分为可溶性基质蛋白和不
4、可溶性基质蛋白，这是基于它们脱矿后在溶液中溶解度的高低区分的。目前对可溶性蛋白的获取主要通过两种方式：脱矿法及不脱矿法。脱矿法通过弱酸如盐酸、乙酸或钙螯合剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra-aceticacid,EDTA)等脱矿后结合色谱法获取蛋白质。但使用盐酸或乙酸的提取方法不适用于可在酸性环境下降解的蛋白质口2,且因几丁质不溶于EDTAzEDTA脱矿法不适用于提取与几丁质结合的蛋白质。不脱矿法则是通过使用水或乙醇作为溶剂，萃取珍珠层中的可溶性基质后结合色谱法获取蛋白质的方法。水萃取法由Almeida等口3在2000年首次提出，在他们的研究中将超纯水与珍珠层粉剂在室温下
5、连续搅拌，离心收集上清液后进行干燥，得到的粉末就是所需物质。Zhang等9进一步提出一种使用磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)萃取的方法，获取的溶液成分与水萃取的可溶性基质类似。乙醇萃取法则是使用无水乙醇提取口4o上述方法用于可溶性蛋白质的提取，不溶性蛋白质多是与有机基质紧密结合的蛋白质，需要更严苛的条件获取。Funabara等15提出一种用于提取分子间通过二硫键交联的蛋白质的电提取法，使用电泳后蛋白质条带的回收装置提取蛋白质。此外，SaSaki等16提出一种通过蛋白酶水解方法研究珍珠层蛋白质及多肽。他们使用来自枯草芽抱杆菌的蛋白酶、核酸素和定向酶22BFz在特定条件下培养，酶促反应结束后,煮沸灭
6、活蛋白酶。3珍珠层活性物质的成骨作用3.1 珍珠层脂质成骨作用珍珠层中的脂质含量占总重量的0.3%0.7%,主要由磷脂、脂肪酸、胆固醇、甘油三酯、类固醇等组成口刀。Ben等11研究射肋珠母贝珍珠层脂质，发现脂肪酸有饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸等，脂质提取率为0.82%o该数据与之前研究的珠母贝珍珠层脂质0.54%的提取率相近18。他们探究了珍珠层脂质对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)的成骨影响，MTT实验和乳酸脱氢酶实验表明珍珠层脂质对细胞无毒性，茜素红染色实验表明珍珠层脂质可促进MC3T3-E1细胞矿化，RT-qPCR实验发现脂质可促进MC3T3-E1细胞骨钙素(OSteOC
7、aIeinQCN)和Runt转录因子2(runt-relatedtranscriptionfactor2,RUnX2)的表达11,而OCN通过控制成骨细胞的活性、调节生物磷灰石排列和作为矿化抑制剂作用于骨形成19,Runx2在成骨早期阶段被激活，是成骨细胞分化的一个必要转录因子20,说明珍珠层脂质对成骨具有积极影响。3.2 珍珠层蛋白质成骨作用3.2.1 P60可溶性蛋白复合物：P60蛋白复合物由Lao等10用乙酸溶解合浦珠母贝珍珠层,用液相色谱法纯化后获得，该蛋白复合物由Nacrein和两个与Nacrein同源的新蛋白N28和N35组成，含有丰富的甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸，亚基之间通
8、过二硫键连接。利用MC3T3-E1细胞和骨髓间充质干细胞研究P60蛋白复合物对成骨作用的影响，发现在vonKossa染色中，第8天即发现矿化结节，提示P60蛋白复合物可促进MC3T3-E1细胞和骨髓间充质干细胞的分化与矿化。NaCrein是一种珍珠层基质蛋白，广泛分布于珍珠层中，具有与碳酸好酶同源的结构域，结构域两侧插有可与钙结合的甘氨酸-Xaa-天冬氨酸(其中Xaa是任何氨基酸)氨基酸重复序列21,而碳酸酊酶可以催化水和二氧化碳形成碳酸氢根离子。但对Nacrein的研究发现它可以抑制钙化，因此，作为Nacrein及其同源的蛋白质组成的蛋白复合物，P60促进细胞分化与矿化的机制有待进一步研究。
9、3.2.2 PIo基质蛋白：PIO基质蛋白从合浦珠母贝珍珠层中使用磷酸缓冲液的不脱钙萃取法，反相高效液相色谱法纯化后获取而来。该基质蛋白的相对分子量为10kDaz含有较多的甘氨酸、丙氨酸和异亮氨酸。通过碳酸钙沉淀及结晶实验证明PlO基质蛋白可以加速碳酸钙析出，促进文石形成。研究发现P10基质蛋白增加人胚肺成纤维细胞及MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的活性,可促进成骨分化9,但有关机制尚不清楚。3.2.3 N16珍珠层蛋白：N16蛋白是从合浦珠母贝珍珠层获取,相对分子量为16kDa,含有较多的甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸。研究发现，当N16固
10、定在基质上时能促进文石晶体的形成，不固定在基质又抑制文石晶体的产生。使用小鼠RAW264.7细胞和MC3T3-E1细胞研究N16对破骨细胞和成骨细胞的影响，发现N16抑制NF-kB受体活化因子配体(RANKL)诱导的RAW264.7细胞分化，口丫咤橙染色表明其减少RAW264.7细胞内酸化,影响破骨细胞功能及抑制破骨细胞相关基因的表达22。同时,N16还可促进MC3T3-E1细胞ALP活性，促进矿化以及上调OCNx骨钙素(osteopontin,OPN)的表达。研究N16对地塞米松诱导的骨质疏松雌性大鼠的影响，表明N16可提高骨密度及骨骼的极限负荷23。Lin等24研究发现N16不仅上调成骨细
11、胞相关基因的表达，而且下调破骨细胞相关基因的表达，两者中主要通过抑制破骨细胞分化来治疗骨质疏松症，其途径可能与M-CSF/c-Fms信号通路及RNAKL/RNAK信号通路有关。因此，N16具有促进成骨和抑制骨吸收的双重调节作用，是骨质疏松症的候选药物之一。其他基质蛋白的潜在成骨作用：PerIUCin和perlustrin是从白鲍珍珠层中提取两种蛋白，相对分子量分别为17kDa、13kDa25oPerlucin具有C型凝集素结构域，能增加碳酸钙沉淀,并促进疏水表面结晶体的形成,C端十肽重复序列的数量将影响沉淀速率26;Perlustrin的N端序列与胰岛素样生长因子结合蛋白N端的结构域同源,具有
12、胰岛素样生长因子的亲和力27。骨组织中的胰岛素样生长因子结合蛋白可以通过调节胰岛素以影响骨代谢，是刺激骨骼形成和重塑的关键，表明Perlustrin具有成骨活性分子的潜力。1.ustrinA从红鲍提取的蛋白质,该蛋白存在富含半胱氨酸和脯氨酸的结构域、富含甘氨酸和丝氨酸的结构域(GS结构域)、碱性结构域和与乳清酸性蛋白(Wheyacidicprotein,WAP)有高度相似C端序列的结构域。Gaume等28对各个结构域作用的研究发现,富含脯氨酸的结构域有助于富含半胱氨酸结构域的自由折叠，有助于参与生物矿化的多个成分的复杂自组装；GS结构域因缺乏芳香侧链没有甘氨酸环而具备弹性；碱性结构域存在带正电
13、荷的侧链，可与阴离子-生物矿化相关分子相互作用，促进蛋白质-蛋白质交联；C端的类似WAP序列的结构域可能有助于提高矿化相关蛋白的稳定性。Oliveira等29利用双向凝胶电泳和液相色谱与串联质谱联用技术从长牡蛎珍珠层水萃取物中鉴定出了4种蛋白质，即胱抑素A2和3种gigasin-2亚型。胱抑素A2是半胱氨酸蛋白酶的抑制剂，含有多肽链中央区域的谷氨酰胺-Xaa-级氨酸-Xaa-甘氨酸序列30。半胱氨酸蛋白酶的抑制剂可以降低骨吸收,促进骨形成,是治疗骨质疏松症的潜在药物31。组织蛋白酶K是一种半胱氨酸蛋白酶，在破骨细胞中高度表达，参与骨组织I型胶原的降解。Bedouet等32此前观察到珍珠层提取物
14、抑制组织蛋白酶K的作用，推测胱抑素A2可能是参与骨吸收的蛋白质之一。Gigasin-2包含有两个表皮生长因子样的结构域,与Wnt抑制因子I(WIF-I)和肌腱蛋白C类似。Wnt信号经典传导通路是通过Wnt蛋白配体与卷曲蛋白(FriZZIed,FZ)受体和脂蛋白辅助受体(LRP5/LRP6)结合启动33oWnt蛋白及其受体在骨组织中高度表达,在调节骨重塑和骨再生中发挥重要作用34。WIF-1可与Wnt蛋白结合抑制信号通路的传导。有研究发现肌腱蛋白C可促进成骨细胞分化，增加ALP活性,促进Wnt信号通路的转录活性35。因此,Gigasin-2的具体作用仍然未知，但通过Gigasin-2的结构特性可
15、以猜测其与骨再生的调控密切相关。Perlwapin和perlihibin是一组与方解石相关的蛋白质。珍珠层中碳酸钙晶体形式主要为文石,方解石主要存在于贝壳的棱柱层。PeHWaPin从白鲍珍珠层中获取,它包含3个与WAP结构域相似的序列，其中一个序列与IustrinA的WAP结构域相似度较高。PeHWaPin对方解石有较强的吸附能力，且饱和碳酸钙溶液透析试验表明该蛋白抑制方解石晶体的形成36。Perlihibin从绿唇鲍珍珠层中获取，含有丰富的半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等，它与方解石特异性结合，抑制了方解石晶体的生长37。N19和pfN44均是从合浦珠母贝中鉴定得到的，N19的碳酸钙沉淀试验证明其
16、抑制碳酸钙结晶，pfN44可与镁相互作用，稳定方解石晶体,抑制文石沉积38-39,两者都存在抑制珍珠层形成的行为。然而,perlwapin.perlihibin.N19和pfN44对骨形成的影响目前未见报道。上述研究的蛋白质主要属于晶体内蛋白质组，珍珠层中还存在框架蛋白质家族，多是与B-几丁质及丝素蛋白凝胶基质相关的蛋白质组，包括MSI60xMSI7、n16x16.3xpif97xPif80、P43、NI4、pearlin等。Pif基质蛋白是在合浦珠母贝珍珠层中发现，该蛋白质在中间序列RMKR裂解位点处裂解形成N端pif97和C端pif8040oPif97存在vW因子A(vonWillebra
17、ndfactortypeA,vWA)结构域和几丁质结合结构域(chitinbindingdomain,CBD)o软体动物VWA结构域的作用主要是参与蛋白质之间的相互作用，CBD包含6个半胱氨酸，可能形成3个二硫键,通过与-几丁质结合参与有机框架的形成41。Pif80具有文石结合活性，通过与Ca2+的相互作用，参与无定形碳酸钙的形成，促进文石形成42。P43是一种不溶性蛋白，由Gong等21于合浦珠母贝中提取，主要分布于文石界面的层间质中经研究是一种框架蛋白。MSl60和MSI7均从合浦珠母贝中提取，MSI60是珍珠层的主要基质蛋白，其含量不足可能影响珍珠层的生长43,MSl7可促进碳酸钙沉淀4
18、4。Pearlinxn16.3和N14同源，提取于不同的珠母贝中，具有CBD结构域，可与几丁质-丝素蛋白在矿化条件下形成凝胶蛋白相进而形成无定形碳酸钙，促进文石生长45。以上框架蛋白质组与骨形成的关系目前未知。4小结与展望骨质疏松症作为一种与衰老相关的退行性疾病，随着老年人口的增加，其发病率也在不断上升。预计到2050年，65岁人口将占总人口的26.1%,可以预见骨质疏松症及其并发症将成为社会沉重的疾病负担46。因此，寻找成骨活性的物质并应用于临床对疾病的预防与治疗有利。珍珠层具有成骨潜力，珍珠层的成骨活性物质有望成为药物研发的来源之一，但目前的相关研究有限。通过蛋白质组学、转录组测序等方法，目前大量蛋白质已被表征47-48,相对于已被鉴定出的珍珠层蛋白及其他成分，只有小部分的生物活性得到研究，成骨活性的研究就更少了。目前许多研究尚停留在细胞层次，对成骨的分子机制、动物实验及临床试验的研究更是有限，珍珠层成骨活性物质有待深度研究。（参考文献略）
