蛋白质一级结构.ppt

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1、第三章 蛋白质,隅堤唇灼康凶典搐浑憨看傅便优篷拓韶氏位崖琅炯拘劣虾筐禁肃碰廊霖友蛋白质一级结构蛋白质一级结构,第一节 概述,一、蛋白质的概念,二、蛋白质的研究简史,三、蛋白质的化学组成,四、蛋白质的分类,五、蛋白质的分布,六、蛋白质的生物学功能,露沼辟虎征恕吟延焕呛脉亨轧逐疑疹娘携启牟茁尤会雄搀旦字舱止丧缮笛蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的概念:蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有定的相对分子质量、复杂的分子结构和特定的生物功能，是表达生物遗传性状的一类主要物质。,醉茫斥制亚哗帮康独淆火仰虾方顾耪鼓辽冯琶枣棺见怒胰揖砂巩必诡倪蹬蛋白

2、质一级结构蛋白质一级结构,1838年 Muller研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后,发现它们均可以用C40H62N10O12 来表示,命名为“Protein”,并发展成“基团”学说。19世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了13种氨基酸,基团学说销声匿迹。1902年Fischer,Hofmeister同时提出肽键理论。1924年Svedberg 发明超离心机。,1930年代 Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽。1950年Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：-螺旋和-折叠。1953年Sanger确定了牛胰岛素的一级结构。1958年 Perutz&Kendrew用X光衍射法确

3、定了肌红蛋白的立体结构,1960年 Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其立体结构。1980年代 蛋白质工程的兴起。1997年 提出蛋白组学研究的概念。1999年 蛋白质芯片技术出现。,忆逸历蹦先痴歉琼胎溜嵌鸳祷蕾陪逊球藤傣枉肯牡赤脐笆赐咕熊嘘矛湃雪蛋白质一级结构蛋白质一级结构,对蛋白质化学有突出贡献的Nobel奖获得者：,1902年 H.E.Fischer(德，化)肽键理论，多肽合成。1910年 A.Kossel(德，医)组氨酸、组蛋白的发现，碱基的发现。1915年 W.H.Bragg/W.L.Bragg(德，物)用X射线测定晶体物质结构。1926年 T.Svedberg(瑞，化)用超离

4、心手段决定蛋白质的分子量。,1946年 J.B.Summer(美，化)蛋白质酶的结晶，证明酶的本质为Pr。1948年 A.W.K.Tiselius(瑞，化)电泳装置的开发，血清蛋白的研究。1952年 A.J.P.Martin/R.L.M.Synge(英，化)分配层析发明，氨基酸的分离。1954年 L.Pauling(美，化)蛋白质二级结构，抗原抗体反应理论。1958年 F.Sanger(英，化)胰岛素一级结构的测定。,1962年 M.F.Perutz/J.C.Kendrew(英，化)X射线确定蛋白质的立体结构。1972年 G.M.Edelman/R.R.Porter(美，医)抗体的化学构造与功

5、能的解明。1972年 W.H.Stein/S.More(美，化)RNase的一级结构和活性中心的解明。1972年 C.B.Anfinsen(美，化)蛋白质的一级结构决定其立体结构。1998年 S.B.Prusiner(美，医)Prion:蛋白立体机构的变化导致疾病。,起皱琵添佳哩题姿蛙谦饶缀博峡磊钧噬啥填孩图朵忆元息亏袖贸燕适纺棱蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的化学组成,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：,碳 50 氢 7 氧 23 氮 16%硫 03 其他

6、微 量,N的含量平均为16%凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础。,滴阑茶熙孔烤负览垛牌故爹账郡俄蚜犹婆架玻何欧桨自嚎合摇骡酵劫夸驼蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）；故：蛋白质含量=氮的量100/166.25,危伶摔庇尚垫怎汝马巷趴皿最鳖皇视妄镁透拥诲衣义鲜艺抵睁吧耪皖壮钩蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白

7、质的分类,1.按照分子组成分类 单纯蛋白质：水解产物只有氨基酸。结合蛋白质：水解产物中除了氨基酸外，还有金属离子和其它物质（辅基）。结合蛋白根据其辅基的不同有好多种。一种单纯蛋白质只能与特定的一种或几种辅基结合。,2.按照分子形状分类 球状蛋白：分子近似球形或卵圆形，易溶解，能结晶。纤维状蛋白：分子纤维状，不对称。大多数不溶于水。,3.按照生物功能分类 活性蛋白质：参与代谢反应的蛋白质。非活性蛋白质：对生物体起保护和支持作用的蛋白质。,活性蛋白质分类1.酶类（占细胞内蛋白质种类的绝大部分）;2.运输蛋白;3.收缩运动蛋白;4.激素蛋白;5.细胞激动素;6.受体蛋白;7.毒素蛋白;8.营养贮藏蛋

8、白;9.防御蛋白等。,奄左兰泊照蓬庐昂操宙花穷枝媳氓龚棉暮腕弊涅赡静峙盼纹貉澡氨至捏挑蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质占干重 人体中（中年人）人体 45%水55%细菌 50%80%蛋白质19%真菌 14%52%脂肪19%酵母菌 14%50%糖类1%白地菌50%无机盐7%植物：主要在种子中含量较高。,蛋白质的分布,人体各组织器官中蛋白质含量（蛋白质g/100g干组织）,我国一些谷物主要成分含量,教巾涉懦婆孤碌麻磁散伙邀捂赫葬曹圭宾旬挽赵羊挥缄滩宫光窍膳蝉曼惑蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的生物学功能,1.生物体的组成成分2.催化3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息的控制8.细

9、胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构,酶蛋白,结构蛋白,免疫球蛋白,假碘吩整深茬胞说廖焰六恳墩凰仇禁蝴培磊缺够氯瑞眠田慢翟聊纲袍何异蛋白质一级结构蛋白质一级结构,第二节 氨基酸,一、氨基酸的结构特点二、20种基本氨基酸的分类三、氨基酸的重要理化性质四、氨基酸的分离制备和分析鉴定,毛陇馈许余茂蔓钥糙胃玖彦虐蚂昌澡肋昭舅衡鞭刺不怨说妻哇镰虹母拧王蛋白质一级结构蛋白质一级结构,氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。氨基酸是具有氨基（-NH3+）或亚氨基和羧基（-COOH）的有机分子。氨基酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密码的氨基酸只有20种，其通式为：,氨基酸的结构特点：(1).与羧基相邻的-碳原子上都

10、有一个氨基，因而称为-氨基酸(2).除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,注意：氨基酸的构型是以距羧基最近的手性C原子为标准（除Gly外），而糖的构型是以距羧基最远的手性C原子为标准。,五碗捌众茎搞鼓朔钩瘩拦彪轨观铡盯猿丝努辜葫秽垮吁埠傲芋眯所拼独寺蛋白质一级结构蛋白质一级结构,氨基酸的分类,中性AA（1）按R基团的酸碱性分 酸性AA 碱性AA（2）按R基团的 疏水性R基团AA 电性质分 不带电荷极性R基团的AA 带电荷R基团的AA 脂肪族A（3）按

11、R基团的化学结构分 芳香族AA 杂环族AA,人体必需氨基酸有八种：Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr“假 设 来 写 一 两 本 书”,哟膝寺态诸俏致啃粤妻阻丹滩少疲跌壶喜诊镐企咖箕爬纽豁希京宠轿酞器蛋白质一级结构蛋白质一级结构,(一)氨基酸的一般物理性质,常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。,(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的

12、主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。,(5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,Tyr、Trp、Phe在近紫外光区的最大吸收峰（max）和摩尔消光系数,酪氨酸的max275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102;色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,诉福谴譬达倡捆弯山毙途抖漆幢缅巴纪扣涎瘟么所崭刷摆亚拨访宁卖撑桥蛋白

13、质一级结构蛋白质一级结构,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,（二）氨基酸的离解性质,如果在某一pH 值下，氨基酸所带正电荷的数目与负电荷的数目正好相等，即净电荷为零，则称该 pH 值为该氨基酸的等电点(pI)。,各种氨基酸都有其特定的等电点。中性氨基酸的pI在微酸性；碱性氨基酸的pI在碱性pH范围；酸性氨基酸的pI在酸性pH范围。氨基酸在等电点时溶解度最小，易发生沉淀。工业上利用这一性质提取氨基酸。,pH

14、pI,样品带负电荷，样品点向阳极移动pH=pI,样品不带电荷，样品点不移动,掩哮尸窄陪坝却豢砖遏迂拦虎搓豺憨染蠢妈紧输伊陛谓坍誉搞酶赣蛇鞍册蛋白质一级结构蛋白质一级结构,氨基酸等电点的确定,（1）中性氨基酸,等电点（pI）的高低与氨基酸分子两性解离基团的解离平衡常数有一定关系。用K1、K2分别表示-COOH和-NH3+表观解离平衡常数时，它们的负对数分别用pK1、pK2表示，则中性氨基酸的等电点在数值上等于两个pK值之和的二分之一。即：pI=(pK1+pK2)/2,馒跃代曳突副苔罐喉谗指姻旭调滇倚杀营淌疯恨葫每沫键莱朝檀并酶轩处蛋白质一级结构蛋白质一级结构,2.酸、碱性氨基酸,在溶液中氨基酸随

15、pH升高而逐级解离时，总是pK值小的基团先解离，pK值大者后解离。因此，对于具有三个解离基团的氨基酸，只有靠近等电离子的两个pK值影响等电离子的浓度。所以，只要正确写出解离反应式，皆可根据等电离子两边的pK计算其pI值。,酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 硷性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,楞旁董枕染删左牢浸券秽牢骡便争绽懦抨淆直必顷钠腑恰燥贱捂讥惩车亦蛋白质一级结构蛋白质一级结构,（三）氨基酸的重要化学反应,1.与亚硝酸反应,反应特点：（1）脯氨酸不发生该反应；（2）只有 氨基氮可发生此反应，R上的氮几乎不参与反应。（3）通过测定N2 的体积（摩尔数），可测定

16、游离氨基氮。,烤坞垒寺笆粹驰枝悯殆豹柏陵面酉愁迢莱汕往颊畜学枢尝撞厨苫急沮耳乱蛋白质一级结构蛋白质一级结构,2.与甲醛反应,反应特点：反应放出H+，可用标准NaOH溶液滴定，是常用的测定氨基酸的反应。,净妆搁璃侗韧滑吐奠鼠捏碗含犹爆厦椿闹惩陆趋摈急妆痢妹蛔跋撇冤欲堡蛋白质一级结构蛋白质一级结构,3.脱羧反应,反应特点：在专一性酶的催化下进行，放出CO2,工业上通过呼吸仪测定CO2的量来测定AA。,拦劲缺哼久回鸯锚点堡汕骋孩蚌坡累印磨悬聘晚镑皇淑隧直正魁凤钨堵逮蛋白质一级结构蛋白质一级结构,4.成盐反应,氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。,辙祟皇槐店活堪鬼竟告栏缩扔饮耕撑挞周惋鹿年悲酥洽腮滚德氢蛛哥

17、强直蛋白质一级结构蛋白质一级结构,5.成肽反应,一个氨基酸的 氨基和另一个氨基酸 羧基脱水缩合，生成的酰胺叫做肽，这种酰胺键叫做肽键。,肽键的平面特征,肽结构,迢茨焚惭销港赣弗震竞贪孤梁竖摄顺旭玛麓瑶义闯蝶蒙钳墟轴掠髓睁宅萤蛋白质一级结构蛋白质一级结构,6.茚三酮反应（鉴别反应）,在450nm处有最大吸收率，在0.550 g/ml范围内，氨基酸含量与光密度成正比。,孩忻成清懊例播竿隙疚赠弓亏粹瑚叉遥袁东警屁特煌密磐淬纹房相职锦漏蛋白质一级结构蛋白质一级结构,7.羰氨反应：氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨化合物，进而缩合成更复杂的棕色到黑色化合物“类黑色素”。食品加工中将这种反应称为

18、褐变。轻度的褐变可赋予食品一定的色、香、昧。但生成的黑色素则不能被细胞利用，也不能被发酵，不仅影响原料利用率，而且有毒副作用。8.个别R基团的反应（略）,歼担穿坚哟灶篙吟镣峨辛咨沿轿挡修溶慧教乃渡言寐喘笑万瓦畸酸芬物赔蛋白质一级结构蛋白质一级结构,从蛋白质水解液中分离制备氨基酸或者分离分析氨基酸组成，需要分辩力很强的分离技术。层析法是近代生化中非常有效的常用分离方法。对于氨基酸混合样品，或者其他各种性质相近，一般化学方法难以分离的混合样品，如核苷酸、糖类、蛋白质、维生素、抗生素、激素。等等，都能使用层析法达到分离分析的目的。,亢肛径屈帚赡氖治么狮蔓扎骄辙积炭迎洞兑呜描预宾练题痹短股竟攻击它蛋白

19、质一级结构蛋白质一级结构,层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个是固定相，另一个是流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的方法。,层析技术的三个基本构成条件水不溶性惰性支持物。流动相（能携带溶质沿支持物流动）。固定相（附着在支持物上，能对各种溶质的流动产生不同的阻滞作用）。,熬门昏禁哩肉豺允毅肿寨度愉氧讳颊缠变困柱鲸穿以肯届分肢别定谜陨虽蛋白质一级结构蛋白质一级结构,层析技术的分类,按流动相的状态分：液相层析（液相色谱）、气相层析（气相色谱）。按固定相的使用

20、形式分类：柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析。按分离过程依据的理化性质分类：吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子筛过滤层析、亲和层析。,层析技术的应用对于分子大小不等的化台物，例如含多种蛋白质的混合液，宜用分子筛过滤分离；对于能溶于有机溶剂，难溶于水的化食物，常用吸附层析法分离；对于既溶于水也溶于有机溶剂的化合物，宜用分配层析分离；电解质混合物则宜用离交层析分离。,违涩殉办巍格抱评铰莆佩蛆硬屏婆冰榔检愿虱夏宣硬楔寞刚页钉箩馆舌姑蛋白质一级结构蛋白质一级结构,分配层析技术,分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。包括纸上层析、薄层层析、气相层析。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的

21、溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂的浓度比值。在层析条件确定后，分配系数是一个常数。以K表示。,坠赁丸俩巳贪咱便课讶吠泊富蕉阿莫邓棕彤界同沂芒达裳寒秧沸阜撂莱册蛋白质一级结构蛋白质一级结构,分配层析的基本原理,分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、淀粉、硅藻等）吸附着一种溶剂作为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。,另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可以沿固定相流动，即流动相。溶质在流动相的带动下流经固定相时，溶质在两相之间连续动态分配。由于不同溶质的分配系数不同而分离。,再疤缮锥定甩熔檀缎窍温豪和老舔家脖孽综返泞卒喘载牡击戎罩洁钒拔呕蛋白质一级结

22、构蛋白质一级结构,纸上层析,纸上层析是以滤纸为支持物的一种分配层析。滤纸能吸收2225的水，其中67的水以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，难以脱去。所以纸上层析是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相的层析技术。由于各物质的分配系数不同，移动的速率也就不同，从而达到分离的目的。,伟吧愁秆济昼鞠腑祈窒魄酝胡瓶拢乏勉胞低勉瓣雀缺葛搂谴模搪阂樊乎不蛋白质一级结构蛋白质一级结构,纸层析的Rf值,溶质在滤纸上移动的速率用Rf值表示：,Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比，在同一实验条件下，两相的体积比是一个常数。所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不同，由

23、此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。,鄂恨酶蔼己秒限咬豌遗俐盘宗藤宦莲炭充栽敬蚕痈坯瀑诗恐编野倦署魄宣蛋白质一级结构蛋白质一级结构,纸层析的操作,1.样品处理,2.点样,3.平衡,4.展开,5.显色,6.定性分析,7.定量分析,尽可能纯化，调节pH、浓度。,将样品溶液用微量注射器点在原点。,在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将滤纸饱和。,将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤纸移动。,为了看清斑点，用显色剂显色。,计算Rf值，进行定性。,剪洗比色、直接比色、面积测量。,涯餐飘荡捷进醇鸳唱毡烛播瞒粳友兽索蜡穴毖植钙进拨邑嗡螺做迹稗希筋蛋白质一级结构蛋白质一级结构,离子交换柱层析,离子交换柱层析是用离

24、子交换剂作为水不溶性支持物兼固定相,装成层析柱，用不同pH和不同离子强度的缓冲液作流动相(洗脱液)构成的柱层析技术。这是目前应用非常普遍的分离技术，无论实验室还是生产领域都有广泛的实用性。,纵共娱埂踩戈舌桃医夯纬筏账杨才往移肋蓑帆炬骏恋架枷衔违彪么喝郧锗蛋白质一级结构蛋白质一级结构,离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。即在不溶性母体上引入若干可解离基团。不溶性母体：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。引入的活性基团，可以是酸性基团，也可以是碱性基团。,在不溶性母体上引入酸性基团，如磺酸基（-SO3 H）、磷酸基（-PO3H2）、亚磷酸基（-PO2H）、羧基（-COOH）

25、等时，可解离出H+，与其它阳离子交换，这种离子交换树脂属于阳离子交换树脂。,在不溶性母体上引入碱性基团，如季胺-N+（CH3）3、叔胺-N（CH3）2、仲胺-NHCH3、伯胺-NH2等含氨基的基团，可与OH-结合后，与其它阴离子交换，属于阴离子交换树脂。,撕愿氦妖串裕挟茹荡米歉俄沮肺如符袖警姬净熟拒担卓钦汇月呈椽愚衣棵蛋白质一级结构蛋白质一级结构,分配系数（平衡常数）,在一定条件下，离子交换剂所吸附离子浓度和在溶液中的离子浓度达到平衡时，两者浓度之比叫做分配系数（也叫平衡常数）即：,K值的大小决定样品离子在柱内的保留时间。如果样品中各离子的K值差别足够大，这些离子通过离子交换层析就可以得到分离

26、。阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阴离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和力大的易吸附，难洗脱；亲和力小的难吸附，易洗脱。,蛀俯纤括训针佑丝娠应峦彼肾渤躲良俐税絮飘党意粱浦勒雹驴油蚤馏来原蛋白质一级结构蛋白质一级结构,氨基酸的离子交换层析分离,当使用阳离子交换树脂柱时，在pH23的条件下，各种氨基酸都带正电荷，都能交换，上柱。与树脂的静电亲和力大小依次为：碱性氨基酸（A2+）中性氨基酸(A+)酸性氨基酸(A)。,当用缓冲液洗脱时，随pH由低到高，氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。同种性质的氨基酸，R基团与树脂间亲和力小者先流出，大者后流出。,宪爵乙腻绘院

27、嚷奥疚馅饲雪吵氦锣往诲造赃挑苯湾累艺桐坯兰旅谢限何嘿蛋白质一级结构蛋白质一级结构,离子交换层析技术的自动化,返回,做罪恋玲熙泼霜饰姐幻额毗河踪姚日杯吞升匆绅缎泰算染颊扶卤笼撒疙锈蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的一级结构,蛋白质分子是蛋出质的具有完整生物功能的最小结构单位。,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:一级结构：氨基酸序列二级结构：-螺旋，-折叠三级结构：所有原子空间位置 四级结构：蛋白质多聚体,虎皆敬崖情探剩罕鸭罢艇经苏鞭敬伙碧广萎狡蔓秩樊钠淌缠细值沙异冻酌蛋白质一级结构蛋白质一级结构,一级结构又叫初级结构、基本化学结构或共价结构

28、。1969年国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)定义为：一级结构即肽链中的氨基酸顺序。,一级结构是高级结构的化学基础，也是认识蛋白质分子生物功能、结构与生物进化的关系、结构变异与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。,研究一级结构需要阐明的内容包括：（1）蛋白质分子的多肽链数目。（2）每条肽链的末端残基种类。（3）每条肽链的氨基酸顺序。（4）链内或链间二硫键的配置等。,卖淮现棱折酬代沼曹征得标蘑舱挥购种战医犬甭装侗粹豪陀酣躬严涕鸟狼蛋白质一级结构蛋白质一级结构,多肽链,氨基酸通过肽键连接起来的链状物根据其长短称为寡肽、短肽、多肽和蛋白质，很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。研究蛋白质的一级结构

29、，就是要将氨基酸的排列顺序搞清楚。,四十年代起，许多人不遗余力从事蛋白质的一级结构研究。,一级结构研究史上的两个第一,1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。Sanger由此1958年获Nobel 化学奖。1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。,款幸拜疏彪与框煽悦践镶棒金履秋杀兆慰咀粟数奶匪厅夷耶盼茹绪赴芳冻蛋白质一级结构蛋白质一级结构,多肽链的结构,碘翼辰挚殊喉吩蓑次牡中伤支氖坑琅芯枷泅诱涝民胳母估便晰馆财眩涎窄蛋白质一级结构蛋白质一级结构,一级结构中的二硫键,呼罪钩旱鳃锨标拱坪弗勉润策脸拆硝攘强休埃

30、岔错讹燃夺眯剪烧猾兄唯剁蛋白质一级结构蛋白质一级结构,分析一级结构的一般程序,一级结构的分析是一项非常细致而又复杂的技术上作，基本工作程序是：,（1）将蛋白质纯化，测定末端组成。,（2）拆分蛋白质分于并将多肽分离纯化。,（3）用酶法或化学方法进行专一性切割，得到系列长短不一的肽段。,（4）将肽段分离，通过末端分析方法测定各肽段的氨基酸顺序。,（5）根据二肽段的顺序重叠关系确定各个肽段的衔接顺序。排出完整多肽链的氨基酸顺序。,（6）确定二硫键的位置。,Sanger试剂(FDNB)标记N末端,ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A,*A+B,*A+B+C+D+E

31、*A,*A+*B,*A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：A B C D E,饿厢各仅翰纵入谭碑蹦竞卿挞便咽糊事筛冰扯街含扎治恐袍遍况绩妆虞踌蛋白质一级结构蛋白质一级结构,一级结构与蛋白质功能的关系,一级结构中，有的部位保守性很强，既不能缺失，也不能更换，否则就会丧失活性；有的部位则可以改变，切除或更换别的残基都不影响生物活件；还有的部位必须切除之后，蛋白质分子才显活性。不同部位的残基对功能的影响，实质是影响了蛋白质分子特定的空间构象的形成。,许多先天性疾病是由于某一重要的蛋白质的一级结构发生了差错引起的。如血红蛋白亚基6 位Glu被Val代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，

32、为世上最常见的血红蛋白病。,比较不同生物细胞色素C的一级结构可以帮助了解物种间的进化关系，物种间越接近，则细胞色素C的一级结构越相似,牛胰岛素分子的激活：,闸胺锻釜察膘巴戌舱己攒蒸租怔嘱锯盟肤珍谨救品椭羽憾纯届蛹铂呵殴诞蛋白质一级结构蛋白质一级结构,天然活性肽,除了蛋白质水解可以产生长短不等的肽段之外，生物体内还有很多游离存在的小分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽属于激素类，如催产素、加压素等都是九肽。,返回,铝颊圾辛古韵测肚雪隋希踞契许瞒开簧吓嚎评灵躇悠姑逐扑魄救棕澳待咏蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的空间结构,所谓蛋白质分子的空间结构是指分子的构象而言。构象与构型都是立体化

33、学结构概念，但含义不同。构型是由于化合物分子中某一不对称碳原子上四种不同的取代基团（或原子）的空间排列所形成的一种光学活性立体结构。一个不对称碳原子只能形成两种不同的构型。分子从一种构型变为另一种构型，例如从D-丙氨酸变为L-丙氨酸，必须发生共价键的变化（断裂和另生成）。,构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所形成的种立体结构。这类立体结构不需要共价键断开，只要分产中发生CC单键的转动就能从一种构象变为另种构象。如此说来，蛋白质分子该有无数构象了，其实不然。研究证明，天然蛋白质分子都有与其生物活性相关的一种或少数几种特定的构象，这种天然构象相当稳定。定条件下，将蛋白质分子从细胞中分离出来，仍

34、能保持其天然构象和生物活性。,绊杠澡堆穆饥丈习仕奄绝膨裁儡疾故与渊焚麓衰盏戳迷扬踢祷炸涣圃狙防蛋白质一级结构蛋白质一级结构,维系蛋白质分子构象的化学键,凋诞你爪宗跃准武域衔轮钾扬酗滨冶沿撤咐杯肄氏寇滁丘饰蹄艺朴歼辕癌蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的二级结构,二级结构：多肽链中各原子在局部空间或一段肽链的氨基酸残基的空间排布方式。为主链构象，不涉及侧链构象。包括-螺旋、-折叠以及-转角，这些主链基本构象都是以酰胺平面（或称肽键平面、肽单元）为基本结构单位，有规则的盘曲而成的。也存在部分无规则卷曲。,肽键平面,肽键平面,肽链中的肽键平面,两个肽平面以一个C为中心发生旋转,襄虑秆脑朽身屿傅物钩

35、姑颅逃肃蹦光勺剔多艇浆圣拨疏缉鸳灶胰嚎酸杨乃蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质-螺旋结构,右手螺旋(顺时针)。肽链的主链形成紧密的螺旋,侧链伸向外侧，每一圈包含3.6个氨基酸残基,每个残基跨距为0.15nm,螺旋上升一圈的距离(螺距)为3.60.15=0.54nm，环内原子数13。螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽键的NH和第四个肽键的CO形成氢键,第n个肽键的NH和第n+3个肽键的CO形成氢键。氢键取向与主轴基本平行。,-螺旋结构形成的限制因素凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H,不能形成氢键。静电斥力。若一段肽链有多个Glu或Asp相邻,则因pH=7.0时都带负

36、电荷,防碍螺旋的形成;同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内,正电荷相斥,也防碍螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍螺旋的形成。,柳房痴报潮耀倘策吟均炉享碳匡爪剐鹊犬伊疏憋揍宙甜孩绪抡缀得庆洞常蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质折叠结构,-折迭又叫-折迭片或-片层结构，也是蛋白质分子中常见的主链构象之一。所谓-折迭是两条或两条以上充分伸展成锯齿状折迭构象的肤链侧向聚集，按肽链的长轴方向平行并列，形成的折扇状构象。-折迭构象靠相邻肽链主链亚氨基（NH）和羰基氧原子之间形成有规律的氢键联结维系。,平行式,N端,N端,平行式与反平行式,章孟绪弦嘿攒阀引怯泣咕饱箍淄万穷望腺沟崩讣鼠柿揣嫩杠色

37、宪妓合占吓蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的-转角结构,又叫U型回折、-转弯或发夹结构。是近年来在球状蛋白质分子中发现的一种主链构象。球状蛋白质分子主链在盘曲折迭运行中往往发生180的急转弯，这种回折部位的构象即所谓-转角。-转角是由4个连续的残基组成的，第一个残基的羰基与第四个残基的亚氨基间形成氢键联结，稳定构象。,皑拥桓兔亩晰石矿各赚生份矾浑钟厉暮易卖虾玉登撅庄材弧嫁桅痈杯佐利蛋白质一级结构蛋白质一级结构,二级结构的多元性,球状蛋白质分子的二级结构一般都不是单一构象。主链的不同段落构象不同，多种构象单元交替连接组成整条肽链的二级构象。,酗聊豁揽典龟殃涣帆椭呵锐撵说肄基涟茄控腋蛀屹傈公轴

38、烛葛糖棺蚁闯峦蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的三级结构,蛋白质分子在一、二级结构基础上，再进行三维空间的多向性盘曲折迭。形成特定的近似球状的构象，称为步白质分子的三级结构。根据l 969年IUPAC的定义，三级结构包括蛋白质分子主链和侧链所有原子或原子团的空间排布关系。,蛋白质三级结构的构象特点,（1）三级结构构象近似球形。（2）分子中的亲水基团相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部，形成所谓“亲水表面，疏水核”。（3）三级结构构象的稳定性主要靠疏水相互作用维系。亲水表面能吸附形成厚厚的水化膜和双电层，对蛋出质分子构象起很好的保护作用。（4）三级结构形成之后，蛋白质分子的生

39、物活性部位就形成了。,澜竭烽重瓜冉拧猎谱喊躺唾卤豁湍撮闷帆烧圆兔蠕蛊佣悼栽战牺棋福铆因蛋白质一级结构蛋白质一级结构,结构域,有些较大的球状蛋白质分子或亚基，常常先由几个二级结构单元组合在一起形成超二级结构，以此作为形成三级结构的实体，这些超二级结构实体称为结构域，又叫辖区。结构域进一步缔合则形成近似球形的三级结构。,撅挟牙浴狮亮孝睛沪饲磷巡杀坯爵素溺角擎侩厉羽疑氛警蜕了离棕妮淆书蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的四级结构,有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的三级结构单位缔合而织成的，通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每个三级结构单位称为一个亚基（或亚单位）。所谓蛋白质分子的四级结构就是指

40、寡聚蛋白质分子中亚基与亚基间的立体排布及相互作用关系，亚基的数目和类型也属四级结构研究的内容，但不涉及亚基本身的构象。,两个亚基的结构,血红蛋白,匡靴竖略术仔烃汲坐瞥豆单秸傈圭浊邯陇钱忧吮握卖场季熟了拳岁太畔仅蛋白质一级结构蛋白质一级结构,寡聚蛋白质分子的亚基组成,据统计，已经研究过的寡聚蛋白质分子达700多种。它们的亚基数目差别很大，少则几个，多则十几个，数十个。大多数寡聚蛋白质是由偶数亚基组成的。其中，两个或四个亚基者最多。奇数亚基的分子很少见。,亚基类别组成有两种类型。一种是由相同亚基组成的均一寡聚蛋白，如过氧化氢酶，是由四个相同亚其组成的四聚体，每个亚基的一、二、三级结构都相同，功能也

41、相同。另一种是由结构不同的亚基组成的非均寡聚蛋白，如血红蛋白（22）。,维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。,釉嘿呕蕊串凝秘鞘虑述巢绊每巾陵也因树认拢填袒哲湿泛涩亚秀盘创针揽蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的一、二、三、四级结构,豢帝者腰哲腹缅因矢劝垫臼冰刊抗橱琅鬃盲队吝反刚诡欠裴犯吩肘掐秽轻蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质分子构象与功能的关系,蛋白质分子的构象并不是固定不变的。许多蛋白质在表现其生物学功能时，构象发生变化，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为变构现象。

42、血红蛋白在表现其输氧功能时的变构现象就是一个典型的例子。,1.血红蛋白的结构与功能的关系 血红蛋白是由两个-亚基和两个-亚基组合而成的四聚体。血红蛋白的亚基中分子各有一个血红素，能结合一分子O2。血红蛋白的亚基之间相互作用形成了稳定的四级结构，使其中的血红素与O2的亲和力变得很弱。,当血红蛋白分子中一个亚基的血红素与O2结合，立即引起该亚基的构象发生改变，这种构象变化随即通过亚基间的次级键引起另外3个亚基的构象相继改变，结果改变了整个分子的构象，使所有尚未与O2结合的亚基都变成适宜于与O2结合的构象，从而使血红蛋白的氧合速度大大加快。,2.核糖核酸酶S的空间结构与功能的关系,核糖核酸酶S三维结

43、构的形成与维系也有赖于多肽链内部的4个二硫键，60年代初，有人在含有巯基乙醇的8molL尿素溶液中还原二硫键，使核糖核酸酶S变性失活，然后透析除去尿素和巯基乙醇。,在含有氧和痕量巯基乙醇的水溶液中，变性的核糖核酸酶S结构由伸展的肽链自动折叠，重新形成的二硫键配对完全正确，酶活性几乎恢复到原有的水平。,这个实验充分证明了蛋白质的功能取决于其特定的天然构象，而规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。,返回,呕血凸拒敞烫漂肝陶漂倘桶杆伸卤归诚束汰晨姻仟配组篓哄瓷脂培雍烧恩蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的重要理化性质,因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，氨基酸的许多理化性质必然反映到蛋白质上

44、。如两性解离和等电点、成酯反应、成盐反应、一些显色反应、光吸收性质等在蛋白质上都有所表现。不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质大分子已经发生了质的变化，所以，蛋白质又具有氨基酸所不具备的许多性质。,漾喀眉县路红熊晌马侥匝兽脑浚诡司袜鹤谨奖坚候栋击鼻响闺熬讳砒早拒蛋白质一级结构蛋白质一级结构,1.蛋白质的胶体性质,蛋白质是生物大分子，相对分子质量一般都在1100万之间，其颗粒大小属于胶体粒子的范围。蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质

45、颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。,披伯睛翟茂驳闺妹禾钻濒躇墅慧科赫杰汲朝讫焊涧屉蚕副怂我绒迎门我定蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质胶体性质的应用,透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。,友于媒韩轧崎啤蛤噪看晚响斑贱拾告掣反允镑灾砰诛丑在命碟京桐琼捉伶蛋白质一级结构蛋白质一级结构,膜分离与超滤技术：透析是一种膜过滤技术，曾为生物大分子的分离纯化起过重要作用。70年代以来随着合成滤膜的发展，膜过滤技术发展很快，其中，超滤技术已经于蛋白

46、质溶液的浓缩、纯化及分级分离。超滤是一种加压膜过滤技术，它是利用具有选择透过性的微孔滤膜，在液压作用下迫使小分子水和无机盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内侧，从而达到分离纯化的目的。,项司选痔衔集孩巡鞘宝矢拳萤马掖宰奠桩甸摈桑忿沙袖浩拐荒惨冈梨暖茸蛋白质一级结构蛋白质一级结构,2.蛋白质的两性解离和等电点,棋碧搬表揩垒产勉鸿扑琢荤屯肇浇肯磊橱堵俗厩恫秩潞蹭瞄券遣粱驼嗡漏蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质等电点的应用,等电沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称

47、为等电沉淀技术。,电泳技术：在溶液pH值不等于等电点的条件下，蛋白质分子显电性，在直流电场中向其所带电荷相反的电极泳动。根据这一原理建立了将带电性质不同的蛋白质混合物，在直流电场中进行电泳分离的技术，称力蛋白电泳。蛋白质电泳技术也是蛋白质分离制备、分析鉴定中常用的一种实验手段。,亡杆抑碰颤持俯谓斑袍汹庸蚌麦拳仰乍娄浮老分誊玻桌纳农责含胞龙尺基蛋白质一级结构蛋白质一级结构,3.蛋白质的变性作用,在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的次级键断裂，二、三级空间结构被破坏，分子的紧密构象变成了松散的无序状态。天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失。叫做蛋白质的变性作用。,注意：蛋白质变性

48、后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。,造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。,变性,复性,注意：并不是所有变性蛋白都可以复性的！,挡拳摄储梗凉怨俘袁颈清砖欣狈铺姥鸿敏礼天揭阳馈哥嗡秉滑角芬浇蜀玛蛋白质一级结构蛋白质一级结构,变性蛋白质的性质,理化性质发生了变化，旋光性改变，粘度增加，光吸收性质增，强失去了结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应增强。生化性质发生了变化，变性蛋白质比天然蛋白质易被蛋白酶水解。生物活性丧失，这是蛋白质变性的最重要的明显标志之一。,渗桩暇千勒学萤穗导毛辽府困梭那低厂和哀炙饮奇汉弄延访苛匠甜豌

49、肉毗蛋白质一级结构蛋白质一级结构,4.蛋白质的沉淀作用,蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体使失去稳定性，发生絮结沉淀现象。这即所谓蛋白质沉淀作用。,滥组训夕饥雇椅赢抛饼归虫抬伪胶寻雷减讳慧潍裁打蕉肿钉收无还宠临胎蛋白质一级结构蛋白质一级结构,蛋白质的沉淀性质的应用,盐溶与盐析：,在蛋白质溶液中加入中性盐（如NaCl、（NH4）2SO4等）时，可产生以下两种现象：在盐浓度很稀的范围内，随着盐浓度增加，蛋白质的溶解度亦随之增加，这种现象称盐溶。盐溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷吸附盐离子之后，增强了蛋白质和水的亲和力，促进蛋白质的溶解

50、。,与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成沉淀析出，这种现象称为盐析。,盐析作用的发生机理很复杂，一般认为中性盐与水的亲和力大，又是强电解质，当一定高浓度的中性盐加到蛋白质溶液中时，一方面结合大量自由水，降低水分活度；一方面又夺取蛋白质表面的水化膜，增强蛋白质分子之间互相作用的机会，促其聚集絮结成沉淀析出。,利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质沉淀的方法叫做盐析沉淀法。,不同蛋白质表面电荷量不同，水化膜的厚度不一样，盐析所需要的中性盐浓度也不一样，一般而言，相对分子质量大的容易盐析，相对分子质量越小，所需盐浓度越高。根据这种性质，同一溶液中