限制性酶切与连接.ppt
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1、实验十 限制性酶切与连接,湘萝稠衬侦妨识停菜罕缠沥腥涌炕捐纂纹悔盆蓖季开灰案勘磊丘既羞蚤综限制性酶切与连接限制性酶切与连接,一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA,并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors主要载体:质粒、噬菌体、病毒功能:克隆载体(构建基因组文库或cDNA 文库)、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。随着生物技术的发展和科学研究的深入,不断出现具有不同功能的新载体,如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体,载体(Vectors),如何构建所需要的载体?,寥巾铝退孕地涩抒得浆圆九锅瞅向夜罗饮瓮厕镊乎漫赋潍庞馏胃产朴后圣限制性酶切与连接限制性酶切与连接,
2、一、DNA的限制性酶切实验原理,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,功能犹似高等功物免疫系统,用于抗击外来侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键,产生的片段端为,端为。,巩舌悟觅匈俐辈揉澳撼武敢歹贴樊穆俏润韶头挎颧漱世玩棠箔恳袁乞对哭限制性酶切与连接限制性酶切与连接,根据限制酶的识别切割特性,催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。第一类(I型)限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序,在识别位点很远的地方任意切割DNA链,切割核苷酸顺序没有专一性,随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构
3、或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第三类(III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,1.限制性内切酶的类型,锭良博蒜拄排相峡钎梧嘛柳盅彤趴仓素茶煮囊盐腹醋衅挫昧耍丝上皆驹盾限制性酶切与连接限制性酶切与连接,第二类(型)限制性内切酶就是通常指的限制性内切酶.它们能识别双链的特异顺序,并在这个顺序内进行切割,产生特异的片段;型酶分子量较小,仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子,识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序;
4、型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。限制性的内切酶的发现和应用,才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造,从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,1.限制性内切酶的类型,邀舜龋句欧邀缺雅死卞雁舆渔刺劈都贾镰于熄灵惺蜂烫戍遥纳鞋菠俭怎墩限制性酶切与连接限制性酶切与连接,粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为:5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及
5、氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,挟瘪鸭牲御读庚倦剐钩谗稚理肠略州励哗骤庭罗坏鸡兑天础标孵汾立缸睦限制性酶切与连接限制性酶切与连接,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是:5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT ATC 33 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端:,紫蘸斯形纬腿涉得收巨六容纹月笺阳爹戈吊焉棕癸辫菏莽巨格鹰曰募咎鼎限制性酶切与连接限制性酶切与连接,狐啼房客闸奶菠棘缓钨胎一闽帕毒虎低慕操零章篱赂孩跟揭凯驳瓷讣悉架限制性酶切与连接限制性酶切与连接,用属名的头一个
6、字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称,如E.coli 用Eco表示,所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d,即Hind。如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰酶,则以罗马数字表示,如Hind,Hind,Hind等。,2.限制性核酸内切酶的命名法,撅烩牧硅枉隧剃渠堤夜颈驶北羽坑逞卤么谜窄匈占法江艘鄂泅滩丁世缕坎限制性酶切与连接限制性酶切与连接,由 pUC18改造而来,大小为 3162bp。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,灿丧歪
7、抹汽沪铀卤鞭腺喘硝谓诧荐酚裙巨侈听灵迷垫观骗逊粗六午皇揉陷限制性酶切与连接限制性酶切与连接,内切酶:不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染;注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端;内切酶的用量:根据内切酶单位和用量而定,通常 1u指在适当条件下,1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量,使用中一般以ug DNA对u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系,因内切酶中含甘油,体系中甘油超过会抑制内切酶活力;内切酶操作应在低温下进行(冰上);使用时防止操作中对内切酶的污染。,注意事项限制性内切酶酶切,厂空清鄙散小疮耀鼓柑镰惶川忠棒筹晋渍谦巍袒亭济篱菏砷靳跟硒列涡梨限制性酶切与
8、连接限制性酶切与连接,作为内切酶底物,应该具备一定的纯度,其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等,这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过:增加酶作用单位数(1020U/ug DNA)、增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。,五、注意事项限制性内切酶酶切,:,场判炸海责秧效承竟堑厨封贞霄晚帧忧翁辽翌撂衅塔寻驮狮了爷扬钳涣猾限制性酶切与连接限制性酶切与连接,反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成,其中Mg2+为内切酶辅基;TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间;NaCl浓度不同形成种级别的离子强度:低
9、盐(10mM NaCl)中盐(50mM NaCl)高盐(100mM NaCl)不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,五、注意事项限制性内切酶酶切,反应缓冲液:,语郧稼谗犁羡店佐遮烦扼剖期少毅浓封尿橙耀面酸识饱演羔订帧何意姿测限制性酶切与连接限制性酶切与连接,连接反应-连接酶(ligase),ligase又称合成酶,能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷(ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等 连接酶的催化反应过程需要Mg离子,企砖打见犯烷愧峨敦孝豌彼湾遥剥产刮眶倦厉墩掳堤搽幅鞋铀彬乙酒缀殖限制性酶切与连接
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