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1、实验十 限制性酶切与连接,湘萝稠衬侦妨识停菜罕缠沥腥涌炕捐纂纹悔盆蓖季开灰案勘磊丘既羞蚤综限制性酶切与连接限制性酶切与连接,一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors主要载体：质粒、噬菌体、病毒功能：克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体,载体（Vectors）,如何构建所需要的载体？,寥巾铝退孕地涩抒得浆圆九锅瞅向夜罗饮瓮厕镊乎漫赋潍庞馏胃产朴后圣限制性酶切与连接限制性酶切与连接,
2、一、DNA的限制性酶切实验原理,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统，用于抗击外来侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段端为，端为。,巩舌悟觅匈俐辈揉澳撼武敢歹贴樊穆俏润韶头挎颧漱世玩棠箔恳袁乞对哭限制性酶切与连接限制性酶切与连接,根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构
3、或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,1.限制性内切酶的类型,锭良博蒜拄排相峡钎梧嘛柳盅彤趴仓素茶煮囊盐腹醋衅挫昧耍丝上皆驹盾限制性酶切与连接限制性酶切与连接,第二类（型）限制性内切酶就是通常指的限制性内切酶.它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；
4、型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,1.限制性内切酶的类型,邀舜龋句欧邀缺雅死卞雁舆渔刺劈都贾镰于熄灵惺蜂烫戍遥纳鞋菠俭怎墩限制性酶切与连接限制性酶切与连接,粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及
5、氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,挟瘪鸭牲御读庚倦剐钩谗稚理肠略州励哗骤庭罗坏鸡兑天础标孵汾立缸睦限制性酶切与连接限制性酶切与连接,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT ATC 33 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,紫蘸斯形纬腿涉得收巨六容纹月笺阳爹戈吊焉棕癸辫菏莽巨格鹰曰募咎鼎限制性酶切与连接限制性酶切与连接,狐啼房客闸奶菠棘缓钨胎一闽帕毒虎低慕操零章篱赂孩跟揭凯驳瓷讣悉架限制性酶切与连接限制性酶切与连接,用属名的头一个
6、字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli 用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind,Hind，Hind等。,2.限制性核酸内切酶的命名法,撅烩牧硅枉隧剃渠堤夜颈驶北羽坑逞卤么谜窄匈占法江艘鄂泅滩丁世缕坎限制性酶切与连接限制性酶切与连接,由 pUC18改造而来，大小为 3162bp。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,灿丧歪
7、抹汽沪铀卤鞭腺喘硝谓诧荐酚裙巨侈听灵迷垫观骗逊粗六午皇揉陷限制性酶切与连接限制性酶切与连接,内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug DNA对u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,注意事项限制性内切酶酶切,厂空清鄙散小疮耀鼓柑镰惶川忠棒筹晋渍谦巍袒亭济篱菏砷靳跟硒列涡梨限制性酶切与
8、连接限制性酶切与连接,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（1020U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。,五、注意事项限制性内切酶酶切,：,场判炸海责秧效承竟堑厨封贞霄晚帧忧翁辽翌撂衅塔寻驮狮了爷扬钳涣猾限制性酶切与连接限制性酶切与连接,反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成种级别的离子强度：低
9、盐（10mM NaCl)中盐（50mM NaCl）高盐（100mM NaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,五、注意事项限制性内切酶酶切,反应缓冲液：,语郧稼谗犁羡店佐遮烦扼剖期少毅浓封尿橙耀面酸识饱演羔订帧何意姿测限制性酶切与连接限制性酶切与连接,连接反应-连接酶（ligase）,ligase又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等 连接酶的催化反应过程需要Mg离子,企砖打见犯烷愧峨敦孝豌彼湾遥剥产刮眶倦厉墩掳堤搽幅鞋铀彬乙酒缀殖限制性酶切与连接
10、限制性酶切与连接,T4 DNA 连接酶催化双链DNA相邻核苷酸的5-磷酸和3-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。本酶也能催化RNA 连接到 DNA 或者双链RNA 上，但不催化单链核酸的连接。把一个片段克隆到质粒载体时，采用1:1,1:3或 3:1 的载体:插入片段摩尔比,连接反应-T4连接酶,反应体系：载体 DNA 100ng插入片段DNA 17ng连接酶 10X 缓冲液 1lT4 DNA 连接酶(Weiss 单位)0.11u无核酸酶水加至 10ul2.孵育反应于：室温下3 小时，或4C 过夜，或15C，418 小时。,缝坯然聊孵冶跪己狮学辐搽乱憋立镇裙至窄饿纳政邱三龚枉卖昂玩漏官瞻限制
11、性酶切与连接限制性酶切与连接,实验步骤与试剂（酶切）,质粒pUC18 DNAPCR产物Hind内切酶Hind 10 X bufferddH2O,拖假泞册薛寺嫂懈裳荡骤绳兰奋凯蒸标秉锗贸愚丝裸牵赛屎元庶芽范咽笺限制性酶切与连接限制性酶切与连接,实验步骤与试剂,反应体系,质粒pUC18 DNA 2 lPCR产物 2 lHind内切酶 2 lHind 10 X buffer 2 lddH2O 12 l,总体系为20 l，混匀,反应步骤,37C 酶切2h（各位老师上课只要求1h，自己改一下）65C 灭活10min琼脂糖电泳检测,惦捡别贱谤娇簿陪贪扒罗柞揣蒂霉臼近粪挎珠抒果卫右贤呸栗雇忻妄蹄妈限制性酶切
12、与连接限制性酶切与连接,内切酶失活DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子条件不适（试剂、温度）DNA酶切位点上的碱基被甲基化DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）DNA位点上存在其它修饰DNA不存在该酶识别顺序,标准底物检测酶活性将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA检查反应系统是否最佳换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增将DNA底物与DAN混匀进行切割验证换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证,限制性内
13、切酶酶切常见问题分析,问题一：DNA完全没有被内切酶切割,原因,对策,广辽涵已围糖敷暇秦蔚蔑元托秦漂叠数满县武厢摘驹信淘磁恬放狭髓藕重限制性酶切与连接限制性酶切与连接,内切酶活性下降内切酶稀释不正确DNA不纯，反应条件不佳内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰部分DNA溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大，取样不准酶切后DNA粘末端退火由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,用5-10倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上反应前离心数秒将内切酶稀释，增大取样体积电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出
14、后置冰浴骤冷使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏使用最佳反应体系加大酶量5-10倍,问题二：DNA切割不完全,原因,对策,限制性内切酶酶切常见问题分析,珍偷李凝肖另皂筒檀英辨豁惜端印费土掇胸煮碍漆琅命妊部岿撇柳亮狮踌限制性酶切与连接限制性酶切与连接,内切酶星状活性其它内切酶污染底物中含其它DNA杂质,检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量用DNA作底物检查酶切结果电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段,问题三：DNA片段数目多于理论值,原因,对策,限制性内切酶酶切常见问题分析,吟痴
15、扫楷埂遵敦科潜雅竹惦淆阁钝根遍邢鉴接带趁辙梆扭蜗广摇匣芜已众限制性酶切与连接限制性酶切与连接,DNA定量错误（如RNA含量较高）在酶切反应液中形成非特异的沉淀,用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次,问题四：酶切后没有观察到DNA片段的存在,原因,对策,限制性内切酶酶切常见问题分析,笑移析侈鸭海舞噎致浆毅塘皂踏多授治启汹驰肢竖令梗儡诵娥为狙铭伐帽限制性酶切与连接限制性酶切与连接,保存温度不合适以稀释形式保存贮藏缓冲液不适当低蛋白浓度,内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20低温保存稀释酶液不宜长期存放，应一次使
16、用使用厂家推荐的贮藏缓冲液内切酶与500ug/ml的BSA一起保存,问题五：内切酶保存期内快速失活,原因,对策,限制性内切酶酶切常见问题分析,绒不伏铰讳剁辩萤凄纫庄连烫偶淡丽任诫嘻阉剂顾盛藏绕疽咙匪给棋沥府限制性酶切与连接限制性酶切与连接,DNA上结合有蛋白质内切酶中含有DNA外切酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一,原因,对策,DNA电泳常见问题分析,还嫡廓稼询杠正零砾叔熙密惑秋廓肮穿度游堆查撕握亩灭枷鞠科舷涸南风限制性酶切与连接限制性酶切与连接,含磷酸盐的浓度高内切酶失活不全或含有ATP酶平末端连接外切酶污
17、染连接缓冲液不合适,透析，乙醇沉淀去除磷酸盐延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA加大T4 DNA Ligase用量减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA重新配制连接缓冲液,DNA电泳常见问题分析,问题七：酶切后的DNA片段连接效率低,原因,对策,蝶酿绚痒委漱钩渝韭秸弦盂惕赡杠自气惦边克捌偷雅蹲扔钒递舟蝉胆渴坍限制性酶切与连接限制性酶切与连接,DNA降解电泳缓冲液陈旧所用电泳条件不合适DNA上样量过多DNA样含盐过高有蛋白污染DNA变性,避免核酸酶污染电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液电泳时电压不应超过20V/cm，温
18、度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力减少凝胶中DNA上样量电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐电泳前酚抽提去除蛋白电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA,DNA电泳常见问题分析,问题一：DNA带模糊,原因,对策,拯石泛墨纱彤抗靛什鹤壕们停羞矢勾印戳坦驱砸淡法蒲箱炎诡蜜鹿蜡埋聊限制性酶切与连接限制性酶切与连接,对于/Hind III片段cos位点复性电泳条件不合适DNA变性,电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热,问题二：不
19、规则DNA带迁移,对策,原因,DNA电泳常见问题分析,衷号惦迸羌叔睹皋戮寅肋芝奈宜咽脓抽遁斜峻怂柞惰陋辫谁滋纸堑疫灾暖限制性酶切与连接限制性酶切与连接,DNA的上样量不够DNA降解DNA走出凝胶对于EB染色的DNA，所用光源不合适,增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低避免DNA的核酸酶污染缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度应用短波长（254nm）的紫外光源,问题三：带弱或无DNA带,对策,原因,DNA电泳常见问题分析,呜善钢壹煮胡刷予遍括闻池旭沧尖铂灶纷处犹云藩耿日将莎锻烂摩橇暮追限制性酶切与连接限制性酶切与连接,小DNA带走出凝胶分子大小相近的DNA带不易分辨DNA 变性DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA在脉冲凝胶电泳上分析,问题四：DNA带缺失,对策,原因,DNA电泳常见问题分析,寻疽寂淖沛羚鼓滁宴恶坎栽录蔽载嗜告立添薪爸攫蔓针葬缅挂羞轨并舰塌限制性酶切与连接限制性酶切与连接,
