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1、膝痛颗粒方对膝骨关节炎大鼠动物模型关节液中炎症因子的影响黄江海I戴雨润2尉志强I方志远I温鑫柱I韩良I李运海I柏立群I赵东方,*(1北京中医药大学东方医院北京I(X)O78；2北京市丰盛中医骨伤专科医院北京Io(X)32)摘要目的：研究膝痛颗粒方治疗大鼠膝骨关节炎的作用机制。方法：将60只SD大鼠随机分为6组：空白组(K)、模型组(三),硫酸氨基葡萄糖组（八）、膝痛颗粒方组(按不同浓度分的浓度L组、中浓度M组、高浓度H组)。造模成功后，用不同浓度的膝痛颗粒方及硫酸氨基葡萄糖胶囊干预，4周后取膝软组织标本进行HE染色来评估其滑膜增生程度；通过ELISA法检测血清中炎症因子(IL-IB)、基质金属
2、蛋白(MMP-3、MMP-13)TNF-的表达情况；对大鼠膝关节滑膜及软骨组织采用免疫组化法检测趋化因子SDF-I蛋白及CXCR4受体的表达情况。结果：LHE染色结果：所有大鼠的膝关节软骨均可见退变，其中模型组大鼠的炎性细胞浸润、滑膜增生纤维样变及软骨破坏表现最重，而高浓度膝痛颗粒方组大鼠的退变程度最轻。2.ELISA法检测结果：药物组和模型组的IL-IB、TNF-a、MMP-3、MMP-13指标均较空白组升高(PVO.05),其中比较不同浓度的膝痛颗粒方组之间的炎症因子和基质金属蛋白酶的水平时发现，四项指标具有相同的趋势，即L组M组H组，M组与L组，PTNF-a、MMP-3、MMP-13in
3、dexofeachtreatmentgroupandmodelgroupwashigherthanthatoftheblankgroup(PMgroup,MgroupandLgroup,PMgroup0.05.TherewasnosignificantdifferencebetweenMgroupandHgroup(PH0.05).3.Resultsofimmunohistochemicalmethod:theSDF-IandCXCR4opticaldensityofmodelgroupandtreatmentgroupwereobviousThepositivecellrateofthebl
4、ankgroupwassignificantlylowerthanthatofthemodelgroup(P0.05),andthepositivecellrateofeachtreatmentgroupwassignificantlyhigherthanthatofthemodelgroup(PA组硫酸氨基葡萄糖组(n=10),膝痛颗粒方组(n=30),其中按照不同浓度的膝痛颗粒方将其随机分为L组低浓度组(n=10).M组中浓度(n=10)H组高浓度(n=10)。1.4 动物处理将各组大鼠右膝关节备毛后，严格消毒后，准备关节穿刺。向K组以外的其他各组大鼠的右膝关节注射药物复制大鼠KOA模型：
5、配制浓度为40mgml的碘乙酸钠生理盐水溶液(MIA溶液)适量，弯曲大鼠右膝关节，使关节间隙充分显露后，向关节内注射50ulMIA溶液。向空白组大鼠，右膝关节注射50Ul生理盐水。观察2周。随机选取3只造模大鼠，麻醉后处死，暴露造模膝关节，肉眼直视下观察关节情况，若出现明显滑膜增厚、软骨水肿或软骨缺损甚至可见软骨下骨者，视为造模成功。造模成功当天即开始灌胃干预。按人和动物间体表面积的等效剂量比值折算给药浓度和剂量：大鼠的等效剂量相当于人的0.15倍。空白组不做任何处理；膝痛颗粒方低、中、高组每天分别以10.5g/kg、21gkg42gkg的膝痛颗粒方水溶液灌胃。模型组每天予以体重相关剂量生理盐
6、水灌胃；硫酸钱基葡萄糖组每天予0.17gkg的硫酸氨基葡萄糖水溶液灌胃。连续灌胃4周。1.5 标本采集血清制备：所有实验动物于末次灌胃1天后，取血清标本。80冰箱保存。关节软骨及滑膜标本采集：切开关节囊后，将增生的滑膜用组织剪小心的取下，置于做好标记的EP管中，迅速置于液氮桶内保存，然后将骸骨、胫骨平台、股骨远端关节面的软骨用手术刀片刮取下来，置于做好标记的EP管中，避免将软骨下骨切下，放入另一液氮桶中冻存。各组随机选5只大鼠，留备后期制备石蜡切片进行HE染色。1.6 实验指标检测HE染色：制备石蜡标本，制作切片，然后进行HE染色，中性树胶封固。ELISA检测：以ELISA实验法检测各组血清标
7、本中炎症因子IL-IB、基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-13)及TNF-的表达水平。免疫组化检测：分别使用大鼠SDF-kCXCR4.II型胶原一-抗及二抗试剂盒对前述所取的大鼠膝关节软骨及滑膜按以下步骤进行制片免疫组化染色。1.7 数据整理与统计分析应用SPSS20.0统计软件分析实验所得数据：计量资料以均数土标准差(xs)表示，组间的计量结果符合正态分布，分析选用独立样本t检验，不符合正态分布则选择秩和检验;用单因素方差分析对多组间的数据结果比较进行分析，P0.05,非显著性差异，无统计学意义；P0.05,显著差异，有统计学意义。对HE染色切片及免疫组化染色的切片应用ImageProPl
8、us软件进行图像分析。2结果2.1大鼠膝关节HE染色结果K组：关节腔完整，滑膜细胞排列规则，软骨面光滑，无炎性细胞浸润。S组：关节腔被滑膜组织中增生的绒毛上皮细胞侵入；可见滑膜组织纤维化及关节面软骨损伤(I11-1V)；腔内炎性细胞聚集；A组:滑膜组织增生，细胞排列基本规整，滑膜细胞伴随大量血管增生，软骨面退变(11o)；1.组：可见滑膜增生伴有部分纤维化，细胞排列紊乱，滑膜细胞局部伴随血管增生;软骨面退变(IIo)；M组：关节腔完整，滑膜细胞伴随大量血管增生，软骨面I退变；H组：关节腔正常，可见少量滑膜细胞增生，排列规则。软骨面光滑。图1各组大鼠膝关节HE染色Fig.1HEstainingo
9、fkneejointineachgroup2.2血清中IL-IB、TIN-、MMP3、MMP-13表达水平的比较结果这四个指标结果比较：空白组较其余五组的明显较低，P0.01;而药物干预组的指标均不同程度的低于模型组，P005,M组及H组的四个指标明显低于A组(P0.01)；在不同浓度的膝痛颗粒方各组之间比较发现药物浓度越高四项指标表达值越低，M组与L组比较，P0.05,无统计学意义。(详见表1)。表1血清中IL-IB、TIN-aMMP-3、MMP-13的含量(xs)Table1contentsofIL-I,tin-a,MMP-3andMMP-13inserum(xs)TNE- Groups
10、IL-I (pgmL)MMP3MMPB(pgmL)(ngnL)(ngmL)K16.745.8834.324.790.720.09*2.630.04S189.636.10240.675.17tt9.98049*9.300.56ttA82.017.12rt*119.863.65*4.720.81m5.980.92r,*H50.643.10*79.544.01tt*2.170.32*4.960.57rt*M56.676.85rt*86.417.51*2.700.505.790.55*L87.587.24rt*123.705.67*4.790.41*6.100.52rt*Note:#:Compared
11、withblankgroupP0.01;*:ComparedwithmodelgroupP0.01.2.3免疫组化检测结果：SDF/和CXCR4表达水平结果比较SDF-I蛋白及CXCR4蛋白在各组大鼠滑膜组织中的表达均有不同程度的升高，其中以S组最为显著。BIank groupMOdd groupGlucosamine group图2各组大鼠SDF-I的表达情况Fig. 2 expression of SDF-I in rats of each groupBlank groupModel groupGlucosamine groupLow concentration groupMedium c
12、oncentration groupHigh concentration group图3各组大鼠CXCR4表达水平Fig.3expressionlevelofCXCR4inratsofeachgroupSDF-I和CXCR4的光密度值比较显示模型组和药物组的阳性细胞率比空白组显著升高，P0.05:S组的阳性细胞率明显高于颗粒方组（L、M、H）P0.05;而膝痛颗粒方组之间比较发现浓度越高,细胞阳性率越低,但仅有这个趋势,结果比较无统计学意义，60.05。（详见表2）。表2SDF-I与CXCR4的表达情况(xs)Table2expressionofSDF-IandCXCR4(xs)GroupsS
13、DF-ICXCR4K0.0210.011*0.0180.005S0.1690.013y0.1910.021,A0.1590.0040.1510.054uH0.0780.016u*0.0750.014*M0.0840.017w*0.0920.003*L0.1190.034w*01200082Note:#:ComparedwithblankgroupP0.05;*:ComparedwithmodelgroupP0.05.3讨论3.1膝痛颗粒方临床应用思维膝骨性关节炎是骨科临床治疗的难题之一，目前尚无能有效阻止该病进展的治疗药物与方法。主要因于膝骨关节炎发生发展的机制复杂，诱因较多，其病因及发病机制
14、尚未完全明确。据临证观察*】，几乎所有KoA患者局部症候都具有“寒”证的表现：关节疼痛,拘挛（晨僵）或屈伸不利，遇寒痛增、得热则减等。故可采用温阳、祛寒对骨关节炎进行辩证治疗。膝痛颗粒方是笔者导师柏立群教授治疗膝OA临证多年的经验方，并开展了多项相关课题研究，经过临床十余年的应用验证，该方在膝骨关节炎的治疗上效果显著小儿其主要成分为川牛膝、白芍、甘草、附子、淫羊番、木瓜、泽泻、伸筋草、茯苓、全蝎、绵革菊、陈皮、砂仁、川苟、当归、桂枝、丹参、车前子、鸡血藤、防风。方中以附子补火助阳以除寒湿；以丹参、川芳、白芍、当归补血活血，又以陈皮、砂仁、防风理气活血；以伸筋草舒筋活血、桂枝温筋通脉、鸡血藤通络
15、止痛，再以茯苓、泽泻、木瓜淡渗利湿，革解通利下焦、车前子除湿止痹，五药合用以祛足膝之湿浊而解痹痛。以淫羊蕾强肾健骨、全蝎通络止痛，牛膝引药下，以甘草调和诸药。诸药合用，温阳驱寒，除湿止痹，又见理气活血、补血填虚，共解膝之痹痛。3.2硫酸氨基葡萄糖与不同浓度的膝痛颗粒对大鼠KOA的影响氨基葡萄糖对关节软骨的生长和修复至关重要，其局部抗炎作用在许多动物实验研究中亦被证实件叫研究中还发现氨基葡萄不影响H型胶原的合成，但可减少II型胶原蛋白的降解。故本研究依据国际权威的OA指南亿2。1中的建议，选用硫酸氨基葡萄糖作为阳性药物对照组。本实验在取材过程中，肉眼直视下发现各组大鼠膝关节负重区软骨退变程度比较
16、：各组均有不同程度软骨水肿、退变及软骨下骨裸露，其中高剂量膝痛颗粒方组最接近空白组。相较于模型组相比，不同浓度的膝痛颗粒方组的炎症因子水平明显降低（PVo.05）,可见膝痛颗粒方有降低OA动物模型关节内炎症反应之效。基质金属蛋白酶的表达量、SDF-I蛋白及其受体蛋白CXCR4也降低，因此可推测SDF-1/CXCR4信号通路的激活可被膝痛颗粒方阻断，使得基质金属蛋白酶的表达下调，进而抑制软骨分解。L、H、M三组模型的检测结果比较，可见中浓度组及高浓度组的炎症因子及MMPS水平明显低于低浓度组，P0.05,而SDFl蛋白及其受体蛋白CXCR4也有随着药物浓度增高而表达减少的趋势。由此可见方药的剂量
17、影响OA病理结果。因此在临床中随证加减方能取得更好地临床疗效。3.3SDF-1/CXCR4信号通在KOA发生发展过程中的分解代谢基质细胞衍生因子（SDFJ）属于CXC趋化因子超家族（又叫CXCLI2）,是组织修复中研究最广泛的趋化因子之一。有研究发现CXCL12能促进体外滑膜成纤维细胞产生IL-6,还可在软骨细胞中诱导MMPI3和其他分解代谢介质，阻断SDF-1/CXCR4信号通路的激活可减少了OA关节的炎症反应和基质金属蛋白酶的表达、抑制软骨退化UE1正常软骨的代谢平衡受到炎症因子的调控。KOA中显著的代谢失衡正是由于细胞因子网络失调的最终表现U久研究证实炎症因子IL-IB和TNF-存在显着
18、的协同作用主导分解代谢I，其可影响聚集蛋白聚糖与II型胶原蛋白的合成1的，并且能激发MMPs及ADAMTS的过度表达；并可放大炎症级联反应、趋化炎症细胞，使其产生大量的COX-2,N0,磷脂酶A2,PGE2,和自由基，进而进一步增加基质金属蛋白前（MMPS）的表达，来抑制II型胶原蛋白和蛋白聚糖的产生，最终分解软骨；还能通过诱导活性氧的产生对软骨产生直接损的伤“7儿本研究中发现S组的阳性细胞率明显高于颗粒方组（L、M、H）P0.05;由此证实了SDF-1/CXCR4信号通路与膝骨关节炎的发生发展具有相关性。木实验结果中显示：SDF-I和CXCR4的光密度值比较显示模型组和药物组的阳性细胞率比空
19、白组显著升高，P0.05;S组的阳性细胞率明显高于颗粒方组（L、M、H）P0.05;而膝痛颗粒方组之间的SDF-I与CXCR4表达有相同的趋势。在炎症因子与基质金属蛋白酶表达的结果比较中显示：空白组较其余五组的明显较低，PvO.01;而药物干预组的指标均不同程度的低于模型组,P0.05,M组及H组的四个指标明显低于A组（P0.01）;在不同浓度的膝痛颗粒方各组之间比较发现药物浓度越高四项指标表达值越低，M组与L组比较，P0.05,无统计学意义。综上可见，膝痛颗粒方通过温阳驱寒治疗膝骨关节炎临床疗效确切，本实验也证实膝痛颗粒方能降低大鼠OA关节中IL-I、TNF,的含量，减轻炎症的级联放大反应，
20、能抑制滑膜细胞产生趋化因子SDF-I的表达，由此我们提出假说膝痛颗粒方可能是通过对SDF-1/CXCR4信号通路的抑制，下调基质金属蛋臼的(MMP-3、MMP-13)的表达，从而抑制软骨分解代谢，进而起到治疗膝关节骨性关节炎的作用，因此我们将在后期课题中继续深入研究相关分子机理。此也为膝骨关节炎的防治提供了新的实验数据，也为膝OA的机理研究提供新思路。参考文献(ReferellCeS)1HEIDARIB.Kneeosteoarthritisprevalenc,riskfactors,patho-genesisandfeatures:partIULCaspianJInternMed,2011,2
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