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1、一、食品安全问题国内2008年奶粉三聚鼠胺，2010年7月又重现江湖；2010年的海南“电豆事件”及“农夫山泉事件”；2010年8月出现的“圣元奶粉早熟事件”国外2010年8月美国的鸡蛋沙门氏菌事件；2010年8月出现的超级细菌事件。2010年10月26日，中国疾病预防控制中心发布信息称，近期检测出三株NDM-I耐药基因阳性细菌。这三个病例分别来自于今年3月和6月提取的细菌样本，特别是两例新生儿病例，基本可以由此排除境外传入的可能。此次所测细菌的实际取样时间，早于英国科学家发现NDM-I之前。这也就表明，早在英国科学家发现超级细菌之前，超级病菌此前就在中国存在。“分别在宁夏和福建查出的含NDM
2、-I耐药基因细菌病例，可以理解成该耐药基因可能已经存在于人群中，只是尚未被检测到。”10月27日，中国疾控中心办公室主任王健在接受本报记者采访时说。二、食品安全快检技术与食品分析的区别内容上；分析手段上；分析的目的。免疫标记技术（放射免疫、荧光免疫、胶体金免疫技术及酶联免疫技术）oPCR（polymerasechainreaction）技术。基因芯片技术。生物酶抑制技术等。三、主要内容（理论）第一章免疫技术重点为ELISA技术第二章基因食品的检测重点为PCR技术第三章食品中有害化学物质的检测重点为胆碱酯酶抑制法测定农药,微生物生长抑制法测定抗生素第四章食品中有害微生物的快速检测重点为微生物的显
3、色培养快速检测法第五章食品中毒素的快速检测重点为生物法测定食品中的毒素第一章免疫学技术第一节有关免疫的基本理论一抗原与抗体的基本理论（一）抗原1抗原的定义完全抗原：进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞（免疫原性），并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质（免疫反应性）。半抗原：只具有免疫反应性。2免疫原性抗原能否成功诱导宿主产生免疫应答取决于三个方面：抗原异质性：抗原物质和宿主本身物质之间的差异，抗原物质的来源和宿主的亲缘关系越远，抗原性越强；分子量：越大，免疫原性越强；化学结构：蛋白质多糖和核酸；支链、环状结构直链，球形线形分子。宿主个体发
4、育、生理状态和遗传性等都对免疫原性有很大影响，所以不同动物，同种动物的不同个体的免疫都有差异。免疫方式主要包括抗原的进入途径、剂量、次数、间隔时间等。3特异性体现在免疫原性及免疫反应性上。一种抗原只能诱发一种特异的免疫应答，结果形成特异性抗体或致敏淋巴细胞；抗原只能与其诱导的特异性抗体或致敏淋巴细胞进行反应，这是其在食品安全快检中得以广泛应用的基础。抗原的特异性是由抗原决定簇决定的，抗原决定簇是抗原分子上具有一定组成和结构的特殊化学基团，多数天然抗原分子通常存在多种抗原决定簇，一般来讲，不同的抗原其抗原决定簇不同，但有时，某一种抗原决定簇也会出现在其他抗原分子上,使其成为共同抗原决定簇，这种抗
5、原决定簇是抗原抗体交叉反应的基础。4抗原分类根据来源分：天然、人工和合成抗原三类，天然抗原指天然的生物、细胞及天然产物；人工抗原指人工化学改造后的抗原，如半抗原经化学改造后就是人工抗原；合成抗原是指化学合成的抗原，比如氨基酸的聚合物。根据水溶性分：不溶的颗粒抗原和可溶性胶体抗原，如细菌的鞭毛、纤毛和菌体都是颗粒抗原；蛋白质、多糖、DNA和真菌毒素都是可溶性胶体抗原。按亲缘关系不同：自身抗原、同种型抗原、异种抗原。按免疫应答机理：普通抗原和超级抗原（极低浓度的抗原产生非常强的免疫效应）。（二）抗体1抗体的定义、分布和分类抗原刺激宿主免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和抗原发生特异性结合的免疫球蛋
6、白（immunoglobin,Ig）。主要存在于动物的血清中，也存在于体液和体外分泌液，如乳汁和细胞分泌液中。Ig包括很多种类，比如人类的Ig可分为IgGIgM.IgA、IgD.IgE五大类，其中IgG、IgA分别可进一步分成IgGhIgG2、IgG3、IgG4和IgAl、IgA2亚类。2抗体的结构以人的Ig为例，IgG、IgDIgE以抗体单体形式存在，而IgM由五个抗体单体通过J链连接在一起的五聚体，因此IgG.IgD.IgE属二价抗体，而IgM为十价抗体。二抗原和抗体的制备（一）抗原的制备1细菌细胞抗原的制备通常将细菌于固体培养基上培养，挑取菌落入无菌生理盐水中，灭菌，离心，用无菌生理盐水
7、配制成菌悬液，备用。2可溶性抗原制备与纯化蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、脂多糖、细菌外毒素等可溶性抗原中相当部分来源于组织细胞，成分比较复杂。通常需要将组织和细胞破碎，经一定的方法纯化后才能获得所需的抗原。（1）通过酶（溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等）消化细胞溶菌酶：主要通过水解肽聚糖的N-乙酰胞壁酸和N乙酰氨基葡糖之间的B-1,4糖甘键，由此可见，更适合于G+；纤维素酶：也能水解B-1,4糖昔键；蜗牛酶：消化腺中发现有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酸、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等多种具有生物活性的混合酶。（2）反复冻融、或者超声波破碎。（3）表面活性剂处理使细胞壁
8、破坏。通过上述三种方法使细胞内容物溢出，通过离心除去细胞碎片即可。如果要制备单一成分的抗原，如蛋白质，还需经过离心、盐析、凝胶色谱、离子交换色谱等方法纯化。3半抗原免疫原的制备及检验属于半抗原的物质是低分子量的物质，如多糖、激素、抗生素、农药及其他化学物晶等。这些小分子物质并不是免疫原，只有与合适载体连接后，才有免疫原性。常见的载体有多聚赖氨酸、竣甲基纤维素（CMC）、聚乙烯毗咯烷酮（PVP）,牛血清蛋白（BAS）、卵清蛋白（OV）等。与载体连接方式：物理方法、化学方法物理法：通过载体（CMC、PVP）的电荷和微孔吸附半抗原。化学法：利用某些功能基团将其连接到蛋白质载体上。如果带有游离氨基或竣
9、基以及2种基团都有的半抗原，可直接与载体连接，如果没有，需改造使其带有游离氨基或竣基才能与载体连接。半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关,一般认为至少要有20个以上的半抗原分子联结到一个载体分子上，才能有效地刺激免疫动物产生抗体。常用吸收光谱法测定。4佐剂与抗原混合，能非特异性地增强抗体应答的物质。目前人和动物用的免疫佐剂主要是金属盐类（氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等）、乳化的水-油佐剂（也称弗氏佐剂，由液体石蜡与无水羊毛脂加热混溶而成，称不完全弗氏佐剂，再加入死分枝杆菌如卡介苗以增强炎性反应，称完全弗氏佐剂，这类佐剂副反应严重，主要用于动物制备抗体）（二）抗体的制备1多克隆抗体的制备多克隆抗
10、体是抗原或抗原与佐剂的混合物按一定程序直接免疫试验动物后获得的抗血清。不同的抗原决定簇刺激不同的B淋巴细胞（抗体产生细胞）克隆产生的抗体混合物，所以称多克隆抗体。（1）动物选择食品安全中检测有害物质和微生物常用的动物为鼠（大鼠、小鼠、豚鼠）和兔子。（2）免疫步骤注射：通常的方案是少量多次。动物产生有效抗体的过程有一定时间规律，一般在首次接触抗原的7-10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14-21天内达到高峰值，这段时期称初次反应，此后一定时间内，如再次接触同一抗原，则特异抗体的生成量将会超过初次反应的许多倍,称二次反应。抗体效价测定：效价在1：16以上，能达到1：64,即可达到要求，应及时采
11、血，否则抗体将会下降。（常用免疫双向扩散法测定）免疫双向扩散法测定效价：溶化琼脂糖放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，冷却凝固，打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50Ul）,周围各孔内分别加入50Pl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37下孵育24h,观察有无沉淀线产生。（3）采血及抗体效价测定采血方式：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血方式。抗体收集：抗体存在血清部分，血液室温凝固lh,4C过夜，血块收缩，将血块离心得残存于其内的血清，收集两部分血清，离心，存贮于-20C或-70C。（4）抗体的纯化及鉴定抗体与所有蛋白质一样，具有一定的溶解度、荷电性、分子大小、疏水程
12、度和配体专一性，因而能够利用盐析沉淀、层析和电泳等技术将抗体分离纯化。抗体纯化要先清楚抗体的用途，用于酶标检测时，只需除去干扰实验的杂质即可。常用的方法有盐析、盐析+凝胶过滤、离子交换+凝胶过滤、阳离子交换+阴离子交换+凝胶过滤、盐析+亲和层析、亲和层析+阴离子交换+凝胶过滤等。鉴定：可以用凯氏定氮法测定其含量、或者分光光度法测定蛋白质含量，也可用凝胶电泳检测其纯度。（5）抗体的保存纯化后的抗体保存十分重要，保存不当，可导致抗体效价下降或消失。常用的方法有：液体保存：抗体经过滤除菌后，加入0.1%的NaN3或硫柳汞以防腐，存于4C可保存半年到一年；低温保存：抗体分成小包装，于20C-4（C保存
13、，一般1年效价不会有明显下降，但应防止反复冻融；冷冻干燥保存：冻干后置于普通冰箱4-5年效价无明显下降。2单克隆抗体的制备单克隆抗体是由单一的B淋巴细胞克隆、针对单一的抗原决定簇产生的均一的免疫球蛋白。因为单克隆抗体的制备是以细胞（包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞和融合子等）为实验对象，在制备过程中采用了细胞融合、细胞培养和细胞克隆等细胞工程技术，因此单克隆抗体又称为细胞工程抗体。B淋巴细胞难以在体外长期存活B细胞肿瘤细胞HAT培养液杂交细胞HAT培养微中氨基蝶咻是叶酸降物0）NA合成，管有次黄够虬型舞是睢，F小鼠鲁髓痛细胞系如X63-Ag8缺乏相应的酶母F能合成DNA,因此在HAT培养假中不能增殖
14、而死亡3单抗与多力施的主要特点比较单抗多抗种属来源小鼠兔子、羊、豚鼠等混合物X纯化、标记易难特异性强差制备周期长（最短4个月）短（2个月）制备技术复杂简单经费多少三抗原或抗体的固定化ELISA方法中，常将抗原、抗体通过物理或化学方法，与不溶水的固相载体相结合,使以后的免疫反应都与固相载体发生联系，便于分离结合和游离的免疫反应物，将蛋白质物质与固相载体连接的过程，称蛋白质的固相化或包被技术。可用作固相载体的材料主要两类：一类是天然有机物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉及他们的衍生物；一类为人工合成的高分子聚合物，如聚苯乙烯、聚氯乙烯等。固定化的既可通过物理吸附方式，也可通过化学偶联方式。第二
15、节免疫学检测技术一免疫沉淀及免疫凝集反应（一）免疫沉淀（单向免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、对流免疫电泳等）根据抗原、抗体在适量电解质存在条件下 发生特异性结合，形 成抗原-抗体复合物 并出现肉眼可见的沉 淀或浑浊，在固体载 体中表现为沉淀线， 液体中出现絮状物或 液体浑浊。由于其灵敏度较低， 通常作定性分析，食 晶安全检测中主要作对流免疫电泳又叫反方向免疫或免疫电渗电泳,是在琼脂扩散基础上结合电泳技术建立的种简便而快速的方法。此方法能在短时间内得出结果，故可用于快速诊断,敏感性比琼脂双向扩散技术高IO16倍。蛋白质抗原Jj抗体球蛋白均为两性化合物.大部分抗K麻性（Ph值8.2）的溶液中
16、带负电荷，在电场中向正极移动，而在同等条件下的抗体球供H用负电营较弱，由于琼脂带有SOj基,隹毋电感应下使琼脂凝胶中的水带正电荷，因而在电场中向负极移动，形成种推力，称为电渗现象。抗体球蛋臼由于在溶液中带的负电荷较弱,在电场作用下难以克服电浴的作用,因而向负极移动，而抗原分子所带的负电荷较强，在电场中可以克服电渗的作用，向正极移动.在同一电场下，抗原、抗体相向运动，在两者相遇且比例适合时便形成肉眼可见的沉淀线。该方法主要用于抗原、抗体的快速检测。为病原菌的定性测定和鉴定。（二）免疫凝集颗粒抗原（细菌、血红细胞等）或可溶性抗原结合于不溶性的载体微粒上后与相应的抗体在适当条件下，经一定时间后凝集成
17、肉眼可见的凝聚物。1直接凝集反应：颗粒抗原+抗体；2反相被动凝集反应：可溶性抗体-不溶性颗粒+抗原；3间接凝集反应：可溶性抗原-不溶性颗粒+抗体。间接凝集反应中的不溶性颗粒如血红细胞、金黄色葡萄球菌的菌体、乳胶、胶体金、磁珠和明胶颗粒等。血红细胞来自于人或别的动物的血液，采血后加入抗凝血剂，然后离心即可获得血红细胞，对于多糖抗原，可以直接吸附，对于蛋白质抗原或抗体须以戊二醛作为交联剂连接。金黄色葡萄球菌的菌体上有一种表面蛋白质，能非特异性地结合在IgG的Fc片段上，而不影响抗体于抗原的结合。乳胶是聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯的微粒溶液，可以直接吸附抗原或抗体，也可引入-CoOH后，将抗原或抗体包被
18、。（三）免疫沉淀及凝集灵敏度免疫学方法灵敏度/L沉淀反应单相免疫扩散试验双相免疫扩散试验火箭免疫电泳对流免疫电泳10-20mgIOmg5mglmg凝集反应凝集反应被动血凝实验10g10g二标记免疫学技术根据标记物不同，标记免疫学技术可分为：酶标记、放射性标记、荧光标记等三种。荧光标记免疫分析是1941年Coons首先建立，放射标记免疫分析是1956年Yelow和BerSOn提出，而酶标记免疫分析技术是受前面两种标记免疫分析技术的启发而建立的。标记免疫学技术的与其他免疫学技术相比，最大的特点是灵敏度大大提高。（一）标记免疫的灵敏度及特点免疫学方法灵敏度/L沉淀反应单相免疫扩散试验双相免疫扩散试验
19、火箭免疫电泳对流免疫电泳10-20mg10mg5mglmg凝集反应凝集反应被动血凝实验10g10g标记免疫技术放射标志免疫分析前标志免疫分析定量荧光标志免疫分析购 +酹 的（2）荧光酶免疫分析：因将荧光底物代替普通底物，通过底物在酶的催化作用下产生的荧光强度来测定抗原抗体反应，提高ELlSA的灵敏度，因为比色测定的极限约为103ugmL,光密度也限定在0.0012.0之间，这些都限制了ELISA的灵敏度，而荧光的测定极限可以达到10-6UgmL,目前ELISA中常用的HRP、AP和BG都有相应的荧光底物。三其他免疫学方法（一）金免疫技术金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在20世纪7
20、0年代初期由Faulk和TayIOr始创，最初用于免疫电镜技术。通常的载体为硝酸纤维素膜。胶体金（Colloidalgold）也称金溶胶（goldsol）,是由金盐（主要是氯金酸（HAUCl4）被还原（柠檬酸钠、糅酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等作为还原剂）成金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金AU）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AUCI2），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金与蛋白质结合一般认为是物理吸附性。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。GB/T19495.8-20
21、04蛋白质检测方法在阳性样品中，由于抗原与金标记的抗体形成的复合物在迁移至抗体时(T带)，被截留，于是红色金颗粒被富集，形成红色条带，而阴性样品中没有抗原存在，尽管红色金标记的抗体也在迁移，但在T带时并不能被截留，所以不出现红色条带。Ab(三)-Ab-Au-AgAb-Ag-Ab-AuAg-Ab-AuAg阳性样品Ab(三)-Ab-Au/Ab-AU阴性样品(二)均相酶免疫测定法(homogeneousenzymeimmunoassay,HEI)RUbenStein等在20世纪70年代初创建的技术。主要特点：无需分离游离的和结并的酶标记物，因而不需要载体。抗原与酶标记物结合后，可使酶的活性受到抑制或
22、激活，但当再与相应抗体结合后，其酶活性被激活或抑制。整个操作过程中，无需将游离的和已形成的抗原-抗体-酶复合物加以分离。均相酶免疫测定主要用于检测小分子半抗原，如激素和药物成分等。可用于此类检测方法的酶类主要有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。此法的检测敏感性低于ELlSA法，但操作简便、快速，准确性和重复件好，所需仪器少，为很多自动化测定系统所采用。第二章转基因食品的检测第一节概述1、转基因生物与转基因食品的定义转基因生物(GMO,geneticallymodifiedorganism)：根据国务院发布的农业转基因生物安全管理条例的规定，利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植
23、物及微生物。基因工程指利用载体系统的重组DAN技术以及利用物理、化学和生物等方法把重组DNA导入到有机体的技术，而传统的杂交育种、细胞融合、化学和物理诱变等技术不被当作基因工程技术。转基因食品就是含有转基因生物成分或者利用转基因生物生产加工的食品。目前主要的转基因食品主要来源于转基因植物。2、转基因生物和转基因食品的发展历史与现状1983年首次报道了转基因烟草和马铃薯；1994年首批转基因植物获得批准进行商品化生产，如延熟西红柿和抗除草剂棉花等；2001年，问世的转基因动物有猪、羊、鱼、奶牛等，转基因酵母和酶等；转基因产品的发展与进出口贸易：转基因作物自1996年的170万公顷增加至2008年
24、的12500万公顷，1999-2003年,美国、阿根廷、加拿大、中国种植了全球99%的转基因作物，以2001年为例，中国占约3%,美国约占68%0转基因的作物主要是大豆、玉米、棉花及油菜。转基因抗除草剂作物面积居第一，其次是抗虫玉米。转基因产品通过贸易进入国际市场,美国、加拿大、阿根廷为主要的出口国，发展中国家是主要的进口国。年份1996-2008年世界转基因作物面积变化图m加拿大中国2001年，美国、阿根廷、加拿大、中国转基因作物 养植比例图二、转基因食品的安全性问题1、转基因食品对人体健康可能产生的影响(1)携带的抗生素基因可能使人与动物的肠道病原微生物产生耐药性。(2)抗虫农作物体内的蛋
25、白醮抑制剂和抗虫毒素，可能对人体健康有害。所以奥地利、卢森堡禁止转基因抗虫玉米进口。(3)抗除草剂农作物的推广，可能导致除草剂用量增加，从而导致除草剂在食品中残留量加大。(4)转基因作物中病毒基因有可能浸染该植物的其他病毒进行重组，产生新病毒或超级病毒。(5)转基因食品进入人体，可能使人出现某些毒理作用和过敏反应，国外已有报道儿童引用转基因大豆豆浆产生过敏反应的报道。2、对生态可能的影响(1)转基因作物本身可能转变成杂草，作物的高产基因通过花粉导入方式给周围杂草，会引发超级杂草出现，对天然森林造成基因污染。(2)美国DPL公司和美国农业部联合申请了一个“终止子技术”的专利，并于1998年获得通
26、过，该技术使作物得到的后代种子不育，许多国家认为，由于外观上无法分清这种种子，如果被出售，播种后可能造成生产的不可弥补损失，通过花粉传播其中的不育基因，导致当地农业崩溃。(3)抗虫、抗病、抗除草剂类转基因作物，除对害虫产生影响外，对环境中许多有益生物也产生直接或间接的影响。(4)用于食品的植物通过基因改良成药用植物,通过花粉会使食用的植物产生药性,污染人类的食品供应。3、各国的态度美国在生物技术的开发及应用走在世界前列，称转基因食品与传统食品一样，是安全的，对人体无害；欧盟等国家认为转基因食品应用于生产和消费的时间尚短，对人类健康及环境的影响尚需长期考察，比如DDT,研制初期经过安全性测试，但
27、经过几十年才发现其残留的危害,。欧盟也有6个国家允许种植转基因作物。认识到转基因生物潜在风险后,有关国际组织和政府已制定和完善其生物安全法规:(1)联合国环境规划署(UNEP,UnitedNationsEnvironmentProgramme)和生物多样性公约(CBD,TheConventiononBiologicalDiversity)秘书处从1994年开始制订生物安全协议书，2000年联合国通过了该协议书，规定了进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做了详细规定。(2)欧盟委员会(EUroPeaneommiSSiOn)的欧洲食品独立权力机构规定：欧盟15国的食
28、品公司和出口至欧洲的外国公司将含有1%以上的转基因成分的食晶贴标，对转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程“跟踪(3)美国要求对非转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程“跟踪”检测，确保非转基因产品不被转基因产品污染。(4)其他许多国家如澳大利亚、新西兰、韩国、日本等国都对基因食品必须标识上作了相应规定。(5)中国国务院于2001年公布并实施了农业转基因生物安全管理条例，并于2002年公布了农业转基因生物安全评价、农业转基因生物进口安全管理办法、农业转基因生物标识管理办法，2006年公布了农业转基因生物加工审批办法;中国国家质检总局于2001年公布并实施了进出境转基因产品检验检疫管理办
29、法。于2009年8月17日依法批准发放了转植酸酶基因玉米“BVLA430101”、转基因抗虫水稻“华恢1号及杂交种Bt汕优63”的生产应用安全证书。2009年年底，转基因抗虫水稻和转基因植酸酶玉米获得农业部颁发的安全证书。这是中国首次为转基因水稻颁发安全证书。第二节我国转基因食品的检测概述一、检测机构国家农业转基因生物安全评价与检定中心，2009年10月开工建设、计划2011年12月投入使用。具有转基因产品定性检测资格的实验室25家，基本是检验检疫局下的实验室，其中广东(广州1、汕头1、深圳1、珠海2),海南没有。二、检测方法的标准2003年12个商检行业标准标准名称标准编号基因检验实验室技术
30、要求SN/T1193-2003（商检标准）植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法SN/T1194-2003大豆中转基因成分的定性PCR检测方法SN/T1195-2003玉米中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1196-2003油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1197-2003马铃薯中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1198-2003棉花中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1199-2003烟草转基因成分定性PCR检测方法SN/T1200-2003植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1201-2003食品中转基因植物成分定性PCR检测方法SN/T1202-200
31、3食用油脂中转基因植物成分定性PCR检测方法SN/T1203-2003植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法SN/T1204-20032、2003年农.业部4个行业标准标准名称标准编号转基因植物及其产品检测通用要求NY/T672-2003转基因植物及其产品检测抽样NY/T673-2003转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化NY/T674-2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法NY/T675-20033、2004年8个国家标准标准名称标准编号转基因植物及其产品检测通用要求和定义GB/T19495.1-2004实验室技术要求GB/T19495.2-2004核酸提取和纯化
32、方法GB/T19495.3-2004核酸定性PCR检测方法GB/T19495.4-2004核酸定量PCR检测方法GB/T19495.5-2004基因芯片检测方法GB/T19495.6-2004抽样和制样方法GB/T19495.7-2004蛋白质检测方法GB/T19495.8-2004第三节DNA提取一、DNA提取与纯化1、样品的研磨和粉碎（1）除杂蛋白质用酶或有机溶剂去除；多糖用合适的酶（果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶等）处理去除或有机溶剂去除；脂类用酶或正己烷去除；RNA,用RNaSe去除；盐类去除。（2）纯化沉淀法：乙醉和异丙醇沉淀浓缩DNA；固体介质吸附法：阴离子交换树脂、二氧化硅
33、、玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。（3）主要方法A、苯酚一氯仿法在高浓度SDS和EDTA的溶液中热裂解细胞，酚/氯仿去除杂质（脂类、多糖、蛋白质及核酸酶），最终用乙醇沉淀DNA并除去盐及残留的氯仿，关键步骤为裂解。该法适用范围广，当分析富含多元醇、叶片或者绿色物质时，很多PCR抑制剂会和DNA共沉淀，会使PCR扩增困难。B、PVP法（POIyVinyIPyIToIidone,聚乙烯毗咯烷酮）在高浓度SDS和EDTA的溶液中热裂解细胞，裂解出的成分（多酚、多糖、新陈代谢成分、蛋白质）和PVP和乙酸铉结合除去，用乙醇沉淀DNA并除去盐。该法适用范围广，尤其适合富含多酚成分的样品。CCTAB（hex
34、adecyl-trimethyl-ammoniumbromide,十六烷基三甲基溪化钱）法该法由CTAB热裂解、抽提（去除多糖及蛋白质）、异丙醇沉淀核酸及乙醇洗涤核酸等步骤组成。在裂解液中加入淀粉酶处理含有淀粉类的样品，加入蛋白酶K除去蛋白质，加入RNaSe去除RNA等。DNA提取时，盐浓度低于0.5moll或室温低于16C时，形成CTAB-核酸共沉淀，在核酸溶解的情况下，可通过提高盐浓度去除与CTAB结合的变性蛋白质和多糖复合物，三氯甲烷可进一步从CTAB和多糖/蛋白质复合物中分离核酸。该法适用于提取植物及植物类产品中的DNA,有效去除多糖及多酚。D、硅藻土法SDS热裂解，盐酸呱存在下，核酸
35、结合硅藻土，异丙醇洗涤，杂质脱离，最后用低盐溶液将硅藻土上的DNA洗脱下来。本法需要三氯甲烷并且要求的离心速度低，可大规模提取并易于自动化。该法适用范围广，也可用于其他方法提取DNA后的纯化，不适合脂类丰富的材料。E、试剂盒法日常检验中一般采用DNA提取试剂盒来提取样品DNA,也是上述几种方法的结合，常用的试剂盒有Promega公司生产的磁珠试剂盒，Qiagen公司生产的柱式离心管试剂盒，Takara公司生产的GMoDNA提取试剂盒，对于深度加工食品，DNA严重降解，含量低，Promega公司生产的磁珠试剂盒效果较好。二、提取DNA的定量1、紫外光谱法（1）原理溶液中的核酸可以吸收210-55
36、0nm的紫外线，在260nm达最高峰。当OD260=1时：双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA浓度为38g/ml；单链RNA浓度为40ugml所以被测对象的ODX50或38或40o（2）说明注意比色杯用石英比色杯；该法也可测定核酸的纯度。本法定量范围为2-50ug/ml,OD值应该在0.05-1之间，但CTAB法中，如果CTAB残留，则干扰测定，因为CTAB在26Onm处有吸收.2、琼脂糖电泳法（1）原理当DNA分子处于分子筛中（比如琼脂糖），在缓冲液存在情况下，处于电场中，根据DNA本身所携带的电荷和分子量，被电泳分离。EB（溟化乙锭）可以镶嵌到DNA分子中，当受紫外线激发时，散发橘黄色
37、的荧光，但EB也可镶嵌至单链DNA和RNA分子中，因此需要酶去除RNA。由于荧光的亮度与DNA量成正比，根据荧光强度，与已知含量的不同浓度的标准DNA进行对比可知DNA溶液的浓度。但应注意,标准DNA的分子量应该和待测DNA的分子量相近，因为荧光的散发和DNA片段的长度相关。（2）说明本法定量范围为5-500ngml（lUg=100Ong）,该法为DNA浓度定量常规方法，尤其是DNA浓度不足以光谱定量时，或纯度不高，或混有某些吸收紫外线的杂质时；可以分析如DNA降解程度、RNA残留的存在和一些污染物，但如果有降解，则不宜使用该法定量。第四节转基因食品的检测一、PCR定性法1、PCR技术简史分子
38、克隆、DNA测序及PCR是分子生物学的三大主流技术。PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好及易自动化等突出优点；可从一根毛发、一滴血，甚至一个细胞扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天、几周的事情，现几个小时便能完成。1971年，H.GhobindKhorana及同事年提出体外扩增的设想（技术条件限制）；1985年，KaryMullis及同事用大肠埃希菌DNA聚合酶I的KlenoW片段体外扩增哺乳动物基因（该酶不耐高温，每一次循环都要重新添加，引物延伸反应在37进行，易发生I爻性模板与引物之间碱基错配，导致合成的产物特异性差，
39、DNA片段不均一）；为此KaryMullis获得1993年诺贝尔化学奖。-71988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶I的Klenow片,段（扩增的DNA片段均一，但仍需加新酶）；=71988年，Saiki等从温泉中分离到嗜热杆菌，其中含耐热-DNA聚合酶一TaqDNA聚合酶。（Taq:thermusaquatics,延伸嗜热水生）。2、PCR技术基本原理最终扩增量：Y=X（l+E）n,其中Y为扩增后DNA的拷贝数；X为起始DNA的拷贝数；E为扩增效率；n为循环次数。初期，DNA增加的拷贝数呈指数形式增长，通常20-30个循环后进入线性增长或静止。长短不一称为长产物片段，长短一致的称短产物片段，显然长产物片段呈算术倍数增加，几乎可以忽略不计，而短产物片段呈指数倍数增加，因此PCR扩增产物不需纯化，可以用于分析与检测。3、PCR技术的反应体系扩增的模板(template)一对寡核甘酸引物、维持PH的反应缓冲系统、一价或二价阳离子、4种dNTPs、
