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1、第六节结核分枝杆菌实验活动风险评估报告一、生物因子（一）一般特性结核分枝杆菌（MyCobaCteriUnlTuberculosi）s,于1882年由德国微生物学家KOCh发现并证实为结核病的病原菌。1886年，Lehman和NCUman正式将其命名为结核分枝杆菌，又称结核菌。1 .形态与染色结核分枝杆菌细长略弯曲，端极钝圆，大小约（14）UmX（0.30.6）um,呈单个或分枝状排列，有时呈V、Y、人字型排列，无鞭毛和芽抱。多数学者认为结核分枝杆菌无荚膜。结核分枝杆菌常用萋-尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸性染色法染色，染色后结核分枝杆菌呈现红色，其他非抗酸性细菌呈蓝色。结核分枝杆菌除正
2、常典型杆状形态外，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等；或受物理因素、化学因素，以及药物等因素的影响，而呈现异常变化；另外，还有可通过在内在电镜下观察细菌滤膜的滤过型、细胞壁缺损或丧失的细胞壁缺陷L型，以及存在于结核病灶、浆液性渗出液等样品可看到的革兰染色阳性颗粒的球状微粒型。2 .生长特性和培养结核分枝杆菌为缓慢生长细菌，较普通细菌生长十分缓慢，在动物体内繁殖代时约为15h,在家兔角膜中约需要2022h,在巨噬细胞内月需要1520h体外生长时营养要求高，可在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素或动物血清等的固体培养基上生长。最适PH6.47.0,在3540可
3、生长，最适温度为3537。常用的培养基有罗氏培养基、小川培养基、油酸血清（白蛋白）琼脂培养基和苏通液体培养基等，在良好的培养条件下，生长代时约1824h,培养24周才出现肉眼可见的菌落。在固体培养基上菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明；而在液体苏通培养基内呈粗糙皱纹状菌膜生长。3 .生化反应结核分枝杆菌能够产生硝酸盐还原酶，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐；在酸性条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺胺、N-甲蔡基乙烯二铁盐酸盐形成红色偶氮化合物。牛分枝杆菌和部分非结核性分枝杆菌不能产生硝酸盐还原酶，因此可用于结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别。结核分枝杆菌缺乏烟酸酶，故不能分解代谢过程中产生的烟酸，在
4、培养中，结核分枝杆菌生长时的烟酸聚集量较牛分枝杆菌及其他分枝杆菌高。烟酸砒咤环的氮与联苯胺及溟化鼠作用后，呈现桃红色或红色沉淀反应。通过烟酸试验可以将结核分枝杆菌同其他分枝杆菌区分。4.免疫学特性抗结核免疫反应在结核分枝杆菌感染中起着根本作用，免疫系统能有效地抵抗大多数感染，感染结核分枝杆菌的大多数人（约9佻）在其一生中并不能发展成患有结核病。然而，当与免疫系统疾病同时存在时，如合并感染人类免疫缺陷病毒（HIV）,发展为结核病的机会就会大大增加。结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。当结核分枝杆菌侵入人体内，被巨噬细胞吞噬后，未活化的巨噬细胞的抗菌活性弱，不能防止所吞噬
5、的结核分枝杆菌生长，但可递呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏。致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因子，如IL-2、IL-6、INF-丫。这些因子与TNF-的共同作用可杀死结核分枝杆菌。结核分枝杆菌的免疫属于感染免疫，又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，则免疫也随之不存在。5.遗传特性结核分枝杆菌基因序列有4400多万bp,包含了4000多个基因，有很高的鸟喋吟（G）和胞啥咤（C）含量。结核分枝杆菌基因组在进化过程中形成了不同的分枝，主要有北京家族、东非-印度分枝、中亚或德里家族、哈勒姆家族、拉丁美洲和地中海家族等，其中北京家族有高毒力和高致
6、病性。6.耐药性结核分枝杆菌产生耐性的机制主要是靶编码基因的突变所致。结核分枝杆菌的自然耐药突变率为10/10-5之间。当结核分枝杆菌的编码基因发生突变后，其对耐药的敏感性表型发生改变，这样的突变是随机、自发的，并和是否与药物接触无关。在一个菌群中，耐药个体的出现是以一定频率产生的，并随着药物对敏感菌体杀灭的选择作用，耐药菌体的比例逐渐增加，直至成为耐药菌优势菌群。耐药结核分枝杆菌可以分为原发耐药、初始耐药和继发耐药，但结核分枝杆菌会出现交叉耐药的情况，即对一种药物产生耐药后，同时又对另一个药物也产生敏感性的改变。（二）来源结核杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病是一种古老的疾病，
7、也许有了人类之后，不久就有了它的存在。1965年，法国学者Sylvius根据解剖了死于所谓“消耗病”或“痍病”人的尸体，发现肺脏及其他器官有颗粒状的病变，根据其形态特征称之为“结核”。1973年，湖南长沙马王堆汉墓出土的2100年前的女尸身上发现左上肺门均有结核病灶。因而，结核的名称就此被应用至今。（三）传染性因结核病病变进展的患者痰中带有大量的结核杆菌，故这类患者是结核病的主要传染源，痰中的结核杆菌越多，传播的危险性就越大。病人出现痰涂片阳性，若ImL痰液中含菌量为100010000,则其痰涂片阳性率为40%50%。病人排菌量越大，其密切接触者的感染率也就越高。结核杆菌菌株之间毒力有较大差异
8、，不同类型的病人排出结核杆菌不仅在数量上不同，其毒力也不同，因而其传染性亦不同。感染的结核杆菌活力越强，数量越大，传染性也越强。感染药物敏感菌的结核病患者在未治疗时的相对传染性为100%。通常，结核病患者经一段时间治疗后，结核杆菌对人的感染能力减弱，相对传染性降为25%；感染耐药菌的病人未治疗时相对传染性为100%,在治疗时则降为27.3%。（四）传播途径结核分枝菌主要通过呼吸道传播，传染源主要是排菌的肺结核病人（尤其是痰涂片阳性，未经治疗者）的痰。飞沫感染为最常见的方式，健康人吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的飞沫而受感染。直径小于IOum的痰滴可进入肺泡腔，或因其重量轻而漂浮于空气中较长时间，在
9、室内通风不良环境中的带菌飞沫，亦可被吸入引起感染。感染的次要途径是经消化道进入体内。少量、毒力弱的结核分枝杆菌多能被人体免疫防御机制所杀灭。仅当受大量毒力强的结核菌侵袭而机体免疫力不足时，感染后可能发病。其他感染途径，如经皮肤、消化道、泌尿生殖系统等均少见。（五）易感性1.宿主范围结核分枝杆菌的宿主包括人、牛、犬、猪、猴、羊等。人、畜、禽类被结核杆菌感染后，在感染个体的机体多种组织内形成肉芽肿和干酪样钙化灶为特征的慢性传染病。2.易感人群结核病主要是人群之间传播的传染病，发生结核杆菌传播主要取决于传染源排菌情况。在受到结核菌感染的人群中只有4%5%的人发生结核病，其余90%以上的人并不发病。3
10、.易感者的自身因素结核杆菌进入人体，引起易感者机体的复杂反应。易感者的身体和心理等状况均可影响机体的反应过程和结果。机体的自然免疫力强、接种过卡介苗（BaCilIUScalmettegu6rin,BCG）或受过感染后获得了免疫力，则能将入侵的结核杆菌杀死或严密包围，制止其扩散，使病灶愈合。（六）潜伏期潜伏期尚不明确，可能为数天、数月、数年。（七）剂量一效应关系传染源排出的飞沫受压力和黏度的影响而大小不一。飞沫核直径为1IoUm者在空气中漂浮的时间长。进入人体末梢气管内越多，越容易传播。豚鼠通过气溶胶途径接触15个结核分枝杆菌感染就可造成肺部感染并导致死亡。小鼠对结核分枝杆菌少见天然感染，静脉注
11、射标准毒株H出250100O万个菌量，可于半月左右发病死亡。而杂种小鼠则需要更大的剂量。不同小鼠株系也有耐受和敏感性程度上的差异。（八）致病性结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、菌体成分和代谢物质的毒性，以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为多见。因肠道中有大量正常菌群寄居，结核分枝杆菌必须通过竞争才能生存并和易感细胞黏附。肺泡中无正常菌群，结核分枝杆菌可通过飞沫微滴或含菌尘埃的方式被吸入，故肺结核较为多见。1.肺部感染由于感染菌的毒力、数量
12、、机体的免疫状态不同，肺结核可以有以下两类表现。（1） 原发感染：多发生于儿童。肺泡中有大量巨噬细胞，少数活的结核分枝杆菌进入肺泡即被巨噬细胞吞噬。该菌有大量脂质，可抵抗溶菌酶而继续繁殖，使巨噬细胞遭受破坏，释放出的大量菌在肺泡内引起炎症，称为原发灶。（2） 原发后感染：病灶亦以肺部为多见。病菌可以是外来的（外源性感染）或原来潜伏在病灶内（内源性感染）。由于机体已有特异性细胞免疫，因此，原发后感染的特点是病灶多局限。一般不累及邻近的淋巴结，被纤维素包围的干酪样坏死灶可钙化而痊愈。若干酪样结节破溃，排入邻近支气管，则可形成空洞并释放大量结核分枝杆菌至痰中。2.肺外感染部分患者体内的结核分枝杆菌可
13、进入血液循环引起肺内、外播散，如脑、肾结核，痰菌被咽入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。结核分枝杆菌缺乏明确的外毒素、侵袭性酶和内毒素。其毒力与素状因子、硫脂、脂阿拉伯甘露聚糖、磷脂、某些分泌性蛋白等有关。但在整体水平和细胞水平仍未得到可满意的解释病原性毒力因子。其致病性可能与在宿主体内顽强增殖和引起机体的病理性免疫反应有关。结核感染和发病时间之间存在着很大的个体差异，感染后数月至数十年发病，甚至可终身无病。欧美在20世纪报道一代感染者中约有5%10%发病。日本在20世纪3040年代统计表明年内发病率为30%,近年报告降低为10%o我国无确切统计数字可依据。在发病者中近半数在感染后半年至两
14、年内于机体抵抗力低时发病。90%的结核菌感染者可保持终生不发病。（九）变异性结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗（BCG）就是Calmette和GUerin2人（1908年）将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株。结核分枝杆菌的耐药性变异随着化疗药物的应用而产生，耐药利福平药物结核分枝杆菌多联系ropB基因突变，而异烟脱、毗嗪酰胺多联系katG和inhA、PnCA基因的突变。一株结核分枝杆菌可以发生多到对十几种药物的耐药，印度等国家就陆续报道了全耐药结核分枝杆菌（TDR-TB）O（+）稳定性1 .在自然环境中的稳定
15、性与对温度的敏感性在自然条件下结核分枝杆菌在室内阴暗潮湿处能存活半年；在干燥的痰中于阴暗处可存活68个月；在随尘土飞扬的空气中可保持传染性810d；在污染的图书上可存活3个月；3条件下存活1年，一68环境下可存活45年。另有资料表明，室内的结核分枝杆菌微滴核约60%71%,可存活3h,48%56%中存活6h,28%32%中存活9h以上。2 .化学灭活结核分枝杆菌直接接触70%75%乙醇530min可被杀死，因此可用于皮肤消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一层把菌体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细菌，通常乙醇不用于痰标本的消毒，1%甲醛处理结核分枝杆菌5min,可使细菌死亡。5%甲醛和痰液
16、等量混合，处理12h以上才能达到杀菌作用。在房间密闭性好、相对湿度60%80%的条件下，使用810g11P甲醛熏蒸12h以上，可有效杀灭空气中和光滑表面物品上的结核分枝杆菌。对结核分枝杆菌污染的室内空气，可用甲醛气体熏蒸的方法进行终末消毒。3 .物理灭活干热180C可达到杀菌目的，杀死痰中的结核菌则需3h以上。结核分枝杆菌对湿热敏感，65C30min或95Imin可杀灭结核分枝杆菌纯培养物；IoOC煮沸5min可杀死痰中结核分枝杆菌。65巴氏消毒法可用于牛奶中结核分枝杆菌的灭活。用600W微波灭菌器照射4min,可将玻璃表面污染的牛型结核分枝杆菌完全杀灭。121C压力蒸汽30in,132C预真
17、空压力蒸汽3min均可杀灭动物脏器、痰或培养基中的结核分枝杆菌。结核分枝杆菌对日光敏感，日光照射2h以上可杀死结核分枝杆菌，紫外线对结核分枝杆菌有一定杀灭作用，用辐射强度在IOoUW4昨以上的30W紫外线灯，在相对湿度50%70%的条件下，照射40min以上，对空气中结核分枝杆菌的杀灭效果可达99.9%以上。(+-)预防和治疗1 .免疫结核病是结核杆菌所致的慢性传染病，具有抗感染免疫的特征，包括先天性免疫和获得性免疫。先天性免疫是抗结核的天然抵抗力，由体表和体内防御系统租成，是非特异性免疫，如体表屏障、呼吸道的纤毛上皮、肺泡巨噬细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、巨噬细胞的吞噬作用、溶菌前的杀菌作用
18、等。获得性免疫是机体受结核杆菌免疫原刺激后产生的针对该病原体的抵抗力，是特异性免疫。细胞免疫起决定性作用，体液免疫无重要影响。目前使用的卡介苗接种可以获得部分免疫性保护，对预防和减少儿童结核病，特别是结核性脑膜炎等的发生起着重要作用，但是对于青少年和成人的保护效果差异较大，不同的人群和不同地区的保护力在0%80%不等，尤其是对HIV感染者，无法接种卡介苗以提供保护。2 .预防药物预防的目的，主要是对那些已经感染结核菌并有较高发病可能的人进行预防性服药以减少结核病的发生。因为健康人受到结核菌感染后不一定发病，是否发病主要受到两种因素的影响，即感染结核菌毒力的大小和身体抵抗力的强弱。对已感染结核菌
19、但没有发生结核病的人进行抗结核药物治疗，其目的是为了尽可能杀死体内感染的结核菌，减少菌量，防止产生或减少已感染结核菌者发生结核病的机会。常用药物预防方法有：利福喷叮加异烟腓，每周服药2次，3个月；单服异烟册每臼1次，6个月。在进行“预防性治疗”时，必须有专业医生指导，排除活动性结核病的存在，服药要进行管理，防止不良反应发生，在知情同意基础上进行。3 .诊断结核病的诊断分为临床诊断和实验室诊断(1)临床诊断肺结核病的诊断参照肺结核诊断标准(ws288-2008)；肺外结核的诊断依据临床症状和实验室结果进行判断。(2)实验室诊断细菌学检测细菌学检测包括涂片显微镜检查、分离培养和药敏试验。标本的选择
20、根据感染部位，可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。涂片显微镜检查是指对获取标本进行染色后显微镜检查，通过形体发现结核分枝杆菌，诊断结核病。该检查简便易行，准确性较高，从痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病，但敏感性低(050%)o分离培养是指对获取的标本经碱性处理后接种于培养基上，观察生长情况，诊断结核病。分离培养的结果可信度高，一般23周内肉眼可见菌落，但个别菌需68周，检测时间长使得应用受到限制。药敏试验是指对分离后的结核分枝杆菌在耐药培养基进行培养，以获得结核分支杆菌对抗结核药物的敏感情况。药敏试验是诊断耐药结核病的主要方法，但传统
21、药敏试验需要4周，影响了耐药结核病的及时诊断。免疫学检测结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验。该方法可以用于结核病筛查，但不能区分自然感染和人工接种感染。细胞免疫介导的结核菌丫干扰素释放试验(T-cellinterferongammareleaseassays,TIGRA又称IFMGRA或GRA)是近年来采用酶联免疫吸附测定(ELlSA)或酶联免疫斑点(ELISPOT)法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的IFN-Y检出释放反应，用于结核菌潜伏感染的诊断。结核分枝杆菌检测是检测体液中的抗结核分枝杆菌的抗体，可以使用EL
22、ISA、胶体金等方法，但特异性和敏感性都不高，仅可作为结核病辅助诊工具。分子检测通过检测结核分枝杆菌或耐药结核分枝杆菌特异的基因片段从而推断结核病，有荧光定量PCR、恒温扩增等方法。该类方法检测周期短，能及时提供检测结果，但需要进行进一步的应用评价。3.治疗结核分枝杆菌是能侵袭机体任何组织、器官引起进行性疾病的致病菌。人型结核分枝杆菌是人类结核病的病原菌，结核分枝杆菌的致病作用可能与细菌在组织细胞内顽强增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生迟发性变态反应性损伤有关。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器宜的结核病，其中以肺结核最常见。临床上肺结核大致
23、可分为四种类型：原发性肺结核、粟粒性肺结核、浸润性肺结核和空洞性肺结核。结核分枝杆菌对一般抗生素不敏感。对链球菌素、异烟腓、利福平、乙胺丁静等药物敏感。对于非耐药结核病有WHo推荐的DOTS发现治疗和管理策略。按照标准的DOT规定，及时就诊、及时确诊、规范治疗和管理，均能治愈。耐药结核病的诊断复杂，治疗困难，往往疗程很长，耐多药病人一般需要1824个月，而且医药费用是治疗一般病人的100倍左右。因此，耐药结核病的治疗对个人、家庭以及社会均造成巨大的经济压力。耐药结核病的临床表现与普通结核病无明显差别，临床症状多种多样，轻重不等，与患者的年龄、机体的免疫状态、营养状态、并存疾病，入侵的结核分枝杆
24、菌的毒力、菌量及病变部位及严重程度等均有关系。临床可表现发热、不同程度的咳嗽、咳痰，部分患者可有咯血，病变广泛时可有呼吸困难等。肺外耐药结核病的临床表现据不同发病部位而不同。耐药结核病的诊断和治疗需到市级以上的专业或定点结核病医疗机构进行诊治，通过标准化治疗方案、个体治疗方案和经验治疗方案的结合，以及特殊治疗措施的实施能达到较好的治疗效果。(二)事故分析1 .实验室本身事故BSL-2及BSL-3实验室中尚未发生过结核分枝杆菌感染事故。2 .有关实验室已发生的事故迄今为止未见有关证实是由于在实验室操作结核杆菌而感染人的报道。二、风险评估与风险控制（一）实验活动1 .实验活动的分险评估所有实验活动
25、根据中华人民共和国传染病防治法病原微生物实验室生物安全管理条例和结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册。2 .实验操作过程（1）菌株的传代操作过程1）在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中是用无菌吸管吸取无菌生理盐水后。加几滴到磨菌管中。2）打开菌株培养管，用灭菌的接种环轻轻刮取菌落，置于磨菌管中。3）使用磨菌棒将菌落制成均匀的菌液。4）静置IOmin后，用吸管接种约0.Iml至中改良罗氏培养基斜面上。5）传代后的培养基放置36培养，每周1次观察菌落生长情况，于肉眼可见菌落出现后23周进行药敏试验。风险因素（见表8-20）o表8-20菌株的传代过程中可能出现的风险及控制措施序
26、号实验操作可能风险风险发生概率风险控制措施残留风险1开盖启开液体溅出较低整个活动中动作轻柔，勿剧烈操作，以防止液体溅出低风险2刮取菌落菌落溅出中整个活动中动作轻柔，勿剧烈操作，以防止菌落溅出低风险3磨菌磨菌管破碎较低整个活动中动作轻柔，以防止磨菌管破裂低分险4接种产生气溶胶较低吸管动作轻柔低分险（3） 菌忌液制备操作过程1）在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取含10%吐温一80无菌生理盐水后，加几滴到磨菌管中。2）用一次性接种棒（环）刮取23周德新鲜菌落，置于磨菌管中。3）注意尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑取1、2个单独菌落进行试验，刮取菌的量以半环或一环（5IOnl
27、g）为宜。4）使用磨菌棒将菌落制成均匀度菌液。5）逐渐滴加灭菌生理盐水，直至菌液浊度与麦氏1号标准比浊管一致，即得到ImgZmL的菌液。风险因素（见表8-21）O月W8-21菌悬液制备立t程中可能出现的风险及控制措施序号实验操作可能风险风险发生概率风险控制措施残留风险1开盖启开液体溅出较低动作轻柔，勿剧烈操作，以防止液体溅出低风险2刮取菌落菌落溅出中动作轻柔，勿剧烈操作，以防止菌落溅出低风险3磨菌磨菌管破碎较低动作轻柔，防止磨菌管破裂低分险（4）菌液稀释和接种操作过程1）菌液稀释：在无菌、带有螺旋盖的试管中以无菌吸管加入2ml灭菌生理盐水备用，每株待测菌准备2管；菌液静置，待颗粒或菌块沉淀：用
28、22S吃标准接种环取2满环Img/mL的菌液，平移至2ml灭菌生理盐水中，即稀释10-2吨/此菌液；用同样方法再进行100倍稀释,即成IOTIng/稀菌液。2）接种：用22SWG标准接种环分别取1满环（即0.01mL）lO2mg111L和10mgnL的菌液，用划线法均匀接种至作为对照的中性改良罗氏培养基及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面；最终接种菌量为l（bmg和10即g。风险因素（见表8-22）O表8-22菌悬液稀释和接种过程中可能出现的风险及控制措施序号实验操作可能风险风险发生概率风险控制措施残留风险1稀释吸管吹动产生气溶胶中吸管操作轻柔，勿剧烈操作，以防止气溶胶的产
29、生低风险2接种液体溅出较高接种环移动的活动中动作平稳，勿剧烈操作，以防止液体溅出低风险（4） 培养操作过程1）接种后的培养基置于恒温培养内，直立放置（361）C培养。2）培养4周后报告结果。风险因素（见表8-23）o表8-23菌悬液培养过程中可能出现的风险及控制措施序号实验操作可能风险风险发生概率风险控制措施残留风险1移送培养管培养管滑落破碎低移送培养管时动作谨慎低风险（二）设施设备设备的风险评估按计划进行，实验人员进入实验室应检查实验室压力是否正常，以确保压力处于正常状态。实验室安排专业公司定期维护保养，建立日常维护计划，每年进行年检；对于生物安全柜和压力蒸汽灭菌器，每年有专人维护、检测；每
30、年举办两次周期性培训，确保人员掌握生物安全柜、压力蒸汽灭菌器的使用规程，以及出现意外事故的应急培训。本实验活动仪器设备相关风险识别与控制见表8-24.表8-24XXXBSL-3实验室结核分枝杆菌实验操作仪器设备风险识别与控制措施仪器名称可能风险发生可能性后果描述控制措施生物安全柜气流异常、生物安全柜出现正压不大可能对实验人员及实验室的高度危险操作培训，设备定期维护。使用时，观察窗不要抬得过高；柜内尽量少放仪器和物品，不要阻塞后面气口处的空气流通；禁止在柜内使用酒精灯；在柜内的所有工作都要在工作台中央或后部进行，并且通过观察窗能看见柜内的操作；尽量减少操作者后面的人员走动，操作者不要频繁移动及挥
31、动手臂以免破坏定向气流，前面的空气栅格不要被吸管或其他材料挡住；生物安全柜的风扇在工作开始前及操作结束后至少要再运行5min实验开始前开启安全柜排风，待压力稳定后再进行实验培养箱二氧化碳泄漏；电源短路；培养物产生气溶胶可能性低人员接触污染1 .每次使用二氧化碳培养箱时，注意观察二氧化碳气表，以及培养箱显示是否正常，确保电源连接正常，电源线周围无液体存在2 .定期更换二氧化碳培养箱的空气滤膜3 .严格规范操作，定期检查离心机离心管发生破裂气溶胶释放可能性低人员接触污染配备离心机有安全套筒，可转移到生物安全柜内处理振荡器产生气溶可能性低人员样品接必须使用塑料的器皿，因为玻璃可能会破裂释放出感染性风
32、险评估报告第X版第O次修订标题：结核分枝杆菌风险评估报告第10页共13页胶、泄露和容器破裂触污染物质，而且可能伤及操作者。在操作结束后，容器应在生物安全柜里才能重新启动冰箱保存管泄露可能性极低人员样品接触污染操作培训，做好个人防护高压灭菌器人员接触高温部位，发生烫伤可能性中等人员发生烫伤操作培训，做好个人防护接种环灭菌器接种环灭菌器温度过低，不能灭菌高度接种环灭菌不彻底定期检修（三）人员1.健康监护和健康状况评估BSL-3实验室人员每年开展健康体检，实验操作前预留本底血清。BSL-3实验室人员健康状况良好。2.人员资质和培训我中心具有开展此项实验活动的技术和人员条件，技术上我中心结核病实验室已
33、经开展了多年的常规结核病检测工作，曾参与两次WHO组织的全球结核病耐药性监测项目。工作人员多年从事结核病实验室工作，具有扎实的理论技术和丰富的实践经验。所有进入BSL-3实验室人员都需经过考察，在近期内均接受过微生物操作技术与实验室安全的系统培训，并经考核确认适合现岗位工作，签署知情同意书。本实验室根据我中心当前及将来业务开展需要，组织制订人员培训计划。在常规微生物操作技术培训的基础上，还需进行消防和预备状态、化学品安全、生物危险和传染预防、救治、紧急医学处理措施的培训。并通过理论和实际操作考核评估每个工作人员对提供的信息的理解力。工作人员要充分了解其实验工作的性质和特点，并正确使用个人防护装
34、备。进入BSL-3实验室须得到实验室负责人的批准，应详细登记出入时间，并保证两名以上的人员同时进入。实验人员素质可能存在的风险及控制措施见表8-25.表8-25XXXBSL-3实验室结核分枝杆菌实验操作人员风险识别与控制明细表潜在风险因素发生可能性后果严重性控制措施实验人技术培训不足或中实验人员需接受相关技术培训并考核合格后方能上岗；定期进行相员技术操作不熟练导致关培训及演练水平误操作人员健实验人员身体状严重实验室工作人员每年参加体检，预留本底血清标本；实验人员进入康水平况不佳或患有基BSL-3实验室前需测量体温，体温高于37C者不能进入础疾病未经授未经授权人员进中进入BSL-3实验室须得到相
35、关部门和实验室负责人的批准，应详细权人员入BSL-3实验室登记出入时间，并保证两名以上的人员同时进入（四）意外事件、事故带来的风险实验室意外事件包括感染性物质的破碎及在台面、地面和其他表面溢出。感染性物质溅入眼睛，皮肤刺伤、误接触污染物（如标识不清、消毒不彻底等原因）、皮肤刺伤是发生概率比较高的感染原因。因此，在实验过程中尽量避免使用利器、实验时穿戴好N95口罩、眼罩及防护服，带高质量双层手套，有接触污染物时应立即消毒并更换新的外层手套。同时，对工作台面及发生溅洒的表面及时进行可靠的消毒灭菌。（五）其他风险控制其他风险控制包括对化学、物理、辐射、电器、水灾、火灾、自然灾害等的风险进行评估。1
36、.工作人员实验活动的非生物风险（化学、物理、辐射、电气）（1） 电气设备安全风险。下列情况存在安全风险。电气设备的设计及制造不符合相关安全标准的要求。需要备用电源的设备未连接备用电源。新的、改装过的或修理过的电气设备在未经专业人员（如有资质的电工或生物医学工程师）完成电气安全测试和设备符合安全使用要求之前使用。电气设备使用人员未接受正确操作培训，操作方式不正确，降低电气安全性。电气设备使用人员未定期检查设备的可能引起电气故障的破损。非专业人员从事电气设备和电路工作。未经授权开展需要授权的工作。未采取措施对设备去污染以减少维护人员受化学或生物性污染的风险。对所有电器设备未定期进行检查和测试，包括
37、接地系统。在实验室电路中未配置断路器和漏电保护器。断路器不能保护人，只是用来保护线路不发生电流超负荷从而避免火灾。漏电保护器用于保护人员而避免触电。实验室的所有电器未接地，未采用三相插头。实验室的所有电器设备和线路不符合国家电气安全标准和规范。（2） 化学风险。下列情况存在安全风险可能通过下列方式暴露于危险性化学品：吸入，接触，食入，针刺，通过破损皮肤。化学品的毒性作用在操作某些化学品或吸入它们的蒸汽时会对人体健康产生不良影响。除了众所周知的毒性物质以外，已知许多化学品都有不同的毒性作用，可能对于呼吸系统、血液、肺、肝脏、肾脏和胃肠道系统，以及其他器官和组织造成不良影响或严重损害，而有些化学品
38、具有致癌性或致畸性。有些可溶性蒸汽在吸入后是有毒性作用的。除了上面所提到的许多严重影响外，发生暴露时还可能导致一些不能被立即识别的对人体健康的损伤，其中可能包括协调性差、嗜睡及类似的症状，并使出现事故的可能性增大。长期反复接触许多液态有机溶剂可能造成皮肤损害，这可能是由于有机溶剂的去脂效果，另外还可能出现过敏和腐蚀症状。实验室未按要求保存满足口常使用量的化学品。大量的化学品未储存在专门指定的房间或建筑物内。相容化学品未分类存放。爆炸性化学品如叠氮化物，通常用作溶液中的抗菌剂，由于轻微碰撞就可能造成叠氮化铜的猛烈爆炸。因此，叠氮化物不应该与铜或铅（如污水管以及管道设施）接触。乙健老化和干燥形成结
39、晶后极不稳定，可能会爆炸。高氯酸如果在木制品、砖砌或纤维性物质上干燥时，一旦碰撞，会发生爆炸并引起火灾。苦味酸和苦味酸盐在加热和撞击时会发生爆炸。化学品可能溢出造成人员伤害，未能及时获得化学品溢出处理的示意图和工具盒。（3） 辐射风险。本实验室不涉及此类风险。（4） 物理风险。本实验不涉及此类风险。2 .防护屏障的风险（正常运行、错误使用、功能失常、清洁、维护和关停期间）（1） 生物安全柜。如果没有按照设备操作规程或使用说明书进行操作、维护，可能使生物安全柜的气溶胶防护效果明显降低或消失，失去安全防护效果。如果设备因长时间使用不能及时更换HEPA,则使用期内的功能失常，如工作窗口气流速度降低或
40、流向紊乱。如果未彻底消毒处理，对于清洁、维护人员将会产生污染。设备长期关停，将会是部分电器元件老化从而失去正常功能。设备的锐角可能会划破防护手套或防护服装，或绊倒人员。（2） 高压灭菌器。如果没有按照设备操作规程或使用说明书进行操作、维护，可能使高压灭菌器效果明显降低或失效，失去去污染与无害化的目的。如果设备因长时间使用不能定期监测灭菌效果，将可能导致污染物扩散环境或感染处理人员。设备长期关停期间，如果内部不能及时排干水分，将会使内部器件老化从而失去正常功能。高压灭菌器内框篓、内腔的锐角可能会划破防护手套或防护服装。（3） 负压罩。负压罩不稳固，容易导致物品滑脱，导致意外污染的发生。杠架上的锐
41、角可能会划破防护手套或防护服装。（4） 个人防护用品。个人防护用品因个人面型而适用于不同型号的防护口罩，不适合的防护口罩将会导致防护效果失效或降低，所以应进行个人适合性测试。同时，BSL-3实验室内所使用的口罩防护效率不应该低于95%,即选用至少N95或FFP2以上的口罩，而不能使用常规无纱布制的单层口罩。（5） 实验室防护设施。设施压差与定向流是防止污染的气溶胶污染扩散的主要二级防护屏障，所以设施应保持总压差为一40Pa,并且保持压差均匀。单级压差低于一IOPa时，则不能保证发挥有效的防护效果。3 .供应品或服务质量的风险（1） 样本容器材质。玻璃容器会导致破碎后的污染物扩散。同时，锐器会导
42、致人员意外的割伤；密封不严的容器容易导致污染流失环境、人员等目标，导致污染或感染事故的发生。（2） 运输包装材料。非UN2814或UN3373包装不能安全有效地防止机械破损，将可能产生污染扩散。（3） 消毒灭菌剂。消毒剂产品无生产许可证、过期或配制方法不正确、种类选择不合理，将会导致消毒效果降低、生物灭活能力降低或对物品腐蚀性增加，对皮肤造成刺激等问题产生。（4） 医疗急救用品。用品种类不适合、不会正确使用、未及时清理维护有期限物品或药齐J,导致急用时无法发挥作用。（5） 废弃物包装。非规范包装容易导致将污染物与生活垃圾混放。导致增加生活垃圾污染风险。同时可能的锐器会无明确的提示而使未接受专业
43、培训的人员发生意外伤害。三、综合评估结论结核分枝杆菌在外界环境相当稳定，主要通过空气传播，宿主范围较广，感染性很强，微量的感染就可使敏感机体感染，但发病率较低。实验室内感染主要以呼吸道传染为主，但也存在非呼吸道感染，应注意实验活动造成创伤从而导致经血感染。耐药结核分枝杆菌感染后造成的危害大于非耐药结核分枝杆菌。虽然卡介苗预防效果尚未肯定，依然建议PPD阴性者进行接种，待阳转后，方可参加相关的实验活动。结核分枝杆菌为二类高致病性病原微生物，除必须在其他实验室进行检测的标本、菌种，在其包装容器外表经消毒处理后方可送出，一般不允许实验室间随意传递结核分枝杆菌标本、菌株。推荐标本涂片、结核分枝杆菌分离培养实验室生物安全防护水平应符合BSL-2要求；进行结核分枝杆菌耐药检测（包括鉴定）实验活动应由我中心审查批准的实验室人员在BSL-3实验室生物安全防护条件下进行。
