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1、第十章抗生素发酵工程,第一节 抗生素概论,一、抗生素的定义传统的定义：抗生素（antibiotic）是微生物细胞产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化学物质。现代定义：抗生素是生物细胞产生的能以低浓度抑制其他生物细胞生长或功能的化学物质 抗生素与药理活性物质的区别：,药理活性物质作用于动植物体本身的生理功能（如免疫调节、降血脂、降血糖、降血压、抗炎、减肥、动植物生长促进、植物生长抑制等等）抗生素作用于动植物体内的寄生（或赘生）生物（细菌、真菌、病毒、癌细胞等）,据世界卫生组织(WHO)1999年统计，全世界每年有1400万人死于感染病，占死亡人数的第一位，其次是心脏病、癌症和脑疾病，分别为
2、750万人、700万人和550万人。一种新的抗生素研制的费用大约需要十几亿美金和10到15年的过程，而使用不当，3到5年病菌就会对这种药物产生耐药性。我国的金黄色葡萄球菌的耐青霉素比例已经高达90%，造成肺炎的病菌在社区的标本有20%可以耐药，而在医院内这一比例可以达到60%。肺炎链球菌已有45%耐青霉素，70%耐红霉素。,二、青霉素的发现者及1945年诺贝尔生理学医学奖获得者,Alexander Fleming(1881-1955),B.Chain(1906-1979),W.Florey(1898-1968),返回,三、微生物产生抗生素,1、放线菌产生的抗生素：链霉菌属：放线菌素、链霉素等6
3、0种类。小单抱菌属：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基环醇类）诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素,2、细菌产生抗生素芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和 枯草芽孢杆菌假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。3、真菌产生抗生素青霉属：青霉素、灰黄霉素。头孢菌属：头孢霉素,四、抗生素的分类（一）,抗生素的分类（二）,抗生素的分类（三）,红霉素A 克拉霉素 罗红霉素 氟红霉素 R1 H CH3 H HR2 O O NOCH2O(CH2)2OCH3 OR3 H H H F,抗生素的分类（四）,作用机制（一）,作用机制（二）,作用机制（三）,作用机制（四）,作用机制（五）
4、,作用机制（六）,五、抗生素产生菌的选育1、抗生素产生菌的分离2、抗菌性试验3、抗生素产生菌的改良(1)人工诱变(2)原生质体融合,(3)体外DNA重组,克隆,六、抗生素的提纯,微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养基的固有成分，这些成分的存在影响抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。,抗生素提纯的基本步骤和原则3个基本步骤：发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制4个原则：时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适宜，pH适度，温度适宜；防止杂菌污染。提取方法：吸附、萃取、离子交换、沉淀色谱分离、分子筛过滤、透析等等,第二节 青霉素的发酵
5、工艺,1、青霉素的产生菌,作为第一个具有临床应用价值的抗生素，1928年被发现，1943年在美国被首次实现工业生产。点青霉的发酵单位很低2U/mL，目前国际上青霉素生产最高发酵单位80000-90000U/mL.生产菌种按其在深层培养中菌丝形态分为：丝状菌和球状菌。黄孢子丝状菌绿孢子丝状菌,2、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性(1)作用机制：抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生溶解而死亡。(2)抗菌谱：作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性细菌。(3)稳定性：弱酸性的有机化合物，干燥纯净
6、的青霉素盐很稳定，pH5-7，6最稳定。,5、青霉素发酵工艺流程及发酵控制,青霉素发酵培养流程,(1)培养基的成分组成和配比对菌体生长发育、发酵单位及质量C源：碳水化合物，葡萄糖、乳糖N源：玉米浆、黄豆粉；硝酸铵、氯化铵无机盐：各种离子前体物质：苯乙胺、苯乙酸(2)发酵工艺控制：二级发酵，菌龄、特性、生长环境(3)补料及控制：糖、硫酸铵、苯乙酸、氨水、玉米油(4)发酵温度、pH及通气搅拌的控制：温度：26-27，pH:6.6-6.9，通气搅拌：1：0.95,(5)青霉素的提取发酵液预处理萃取脱色反萃取过滤洗涤干燥发酵液预处理：A 加热使蛋白质变性沉淀；B 加絮凝剂使蛋白质沉淀 C 固液分离离心
7、萃取工艺过程：二级逆流萃取,A、萃取目的：杂质多，含量少。原理：分配定律，青霉素G在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，不溶于有机溶剂。青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，6.2-7.2，形成盐转入水相中，实现反萃取。,B、影响萃取因素a、pH：反复调节pH，青霉素不稳定，易发生降解、异构化、重排，-内酰胺环是功能性。b、温度：加热会加快其降解反应c、工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率越低。d、微生物污染：杂菌：-内酰胺酶和青霉素酰胺酶e、萃取时间：青霉素在水中的半衰期18.5min。,6、青霉素的精制制成碱金属
8、盐：碱金属盐稳定性大；青霉素在水中的稳定性差，水解快。(1)结晶工艺：A、醋酸丁酯中直接结晶：加入醋酸钾-乙醇-碳酸钾、丁醇-水真空共沸蒸馏。B、丁醇-水共沸结晶：青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。,(2)过滤、洗涤、干燥结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥采用真空双锥旋转干燥器，7、溶媒回收采用立式传质塔蒸馏回收。,一、斜面培养：淀粉1，硫酸铵0.3、玉米粉0.61.0、氯化钠0.3、蛋白胨0.2、琼脂2、pH7.07.237培养710d，成熟的孢子灰色略带微红色。一级种子培养：豆饼粉2
9、.5、葡萄糖3、淀粉4、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸铵0.5、玉米粉0.2、氯化钠0.3、磷酸氢二钾0.06、硫酸镁0.025、豆油0.335 培养72h，菌丝密集,红霉素的发酵生产,二级种子：豆饼粉2.2、葡萄糖3、淀粉4、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸铵0.1、玉米粉0.8、氯化钠0.3、碳酸钙0.6、豆油0.335，24h，接种量10二、发酵罐培养发酵培养基：豆饼粉2.4、葡萄糖3、3.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸铵0.1、玉米粉0.8、氯化钠0.3、碳酸钙0.6、豆油0.15，丙酸0.6（分次加入）60h前35，60h后33,菌丝繁殖期：接种45h后，菌丝生长快，繁殖旺盛
10、，迅速利用N、C，菌丝体密集成网状。红霉素分泌期：45h150h，菌丝体生长减弱，并达到平衡，pH在7.2左右，c源利用较快，红霉素持续分泌。菌丝自溶期：菌体衰老，发酵液颜色较深，菌丝短，粘稠度较大，pH上升7.5，氨基氮上升。,3、红霉素的提取和精制,红霉素是一种有机碱化物，在碱性条件下溶于有机溶剂中，在酸性条件下溶于水中。,提取工艺,发酵液 过滤 滤液 酸化液,加甲醛、硫酸锌,pH8.28.8,(26000 r/ml),加氢氧化钠静止,碱化,调节pH1010.5,分层、离心,醋酸调节pH55.5,静止分层,酸化液,5加丙酮,冷冻结晶,结晶,洗涤,干燥,成品,1、发酵液预处理0.10.2甲醛：杀菌使蛋白凝集变性46硫酸锌：去除酸性蛋白，助滤并用碱液调节pH8.28.8，稳定红霉素2、滤液处理计算添加醋酸丁酯添加量，用碱液调节pH1010.5，3033左右，红霉素溶解于有机溶剂中。,气流干燥 80-90C,3、醋酸丁酯液处理：10醋酸调节pH55.5，分层，去除醋酸丁酯液，在酸性环境下溶于水溶液中分层过滤酸液处理用10氢氧化钠调节pH78，再加适量的醋酸丁酯，二次萃取。静止分层最终得到溶解于水中的红霉素再经过冷冻结晶，真空干燥得纯品。,
