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1、附件植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS2017071范围本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。2原理提取试样中基因组DNA,以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分。3试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要
2、求。所有试剂均用无DNA醐污染的容器分装。3.1 核桃源性成分基因检测用引物对序列为：核桃5,端引物:5-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3核桃3，端引物：5-Gactcatgtctcgacctaatgctt核桃探针：5，-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-33.2 花生源性成分AWb2基因检测用引物（对）序列为：花生5端引物:5-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3花生3端引物:5-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3花生探针：5,-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3,3.3 杏仁源性
3、成分PWdw基因检测用引物（对）序列为：杏仁5,端引物:5LTTTGGTTGAAGGAGATGeTC-3杏仁3，端引物:5,-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3杏仁探针：5Fam-Tccatcagcagatgccaccaac-ECliPSe-33.4 芝麻源性成分2SalbumimmRNA基因检测用引物（对）序列为：芝麻5端引物:5,-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3芝麻3，端引物5-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3,芝麻探针：5，-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC-TAMRA-3,3.5 榛子源性成分HeQSi基因检测用引物（对）序列为：榛
4、子5,端引物5-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3榛子3端引物:5-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3榛子探针：5,-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT-Eclipse-3,3.6 大豆源性成分LeC制基因检测用引物(对)序列为：大豆5端引物:5-GCCCTeTACTCCACCCCCA-3大豆3，端引物:5,-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3大豆探针：5,-fam-AgcttcgccgcttccttcaACTTCAC-TAMRA-33.7 真核生物18SrRNA内参照检测用引物(对)序列为：内参照5,端引物:5，-TcTGCCCTATCAACT
5、TTCGATGGTA-3，内参照3端引物：5-AATTTGCGCGCCTGeTGCCTTCCTT-3内参照探针：5,-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMRA-3,3.8 CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCL20mmol/LEDTA,100mmol/LTris,用10%盐酸调节PH至8.0,121C高压灭菌20min,备用。3.9 蛋白酶K：20mgmLo3.10 苯酚：氯仿：异戊醇(体积比：25:24:1).3.11 异丙醇。3.12 70%乙醇。3.13 TaqDNA聚合酶。314dNTP混合液。3.15 TE缓
6、冲液(TriS-HC1、EDTA缓冲液)：1Ommol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)O3.16 10PCR缓冲液：200mmol/LKCL15mmol/LMgCl2,200mmol/LTris-HCl(pH8.8)04仪器和设备4.1 组织研磨器。4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。4.3 恒温水浴锅。4.4 离心机：离心力12,000g。4.5 微量移液器(0.5L10L,10L100L,10L200L,100L1000L)。4.6 实时荧光PCR仪。4.7 涡旋振荡器。4.8 天平：感量0.0Igo5分析步骤5.1 试样总DNA的提取固体样品：
7、将样品粉碎后称取0.30.6g,按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。液体样品：取ImL样品于EPPOrdOrf管中，加入1倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5min,室温下以12,50OrPm离心5min,弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA,也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。(1)将处理后的样品加入2mL离心管中，加入600LCTAB缓冲液和40L蛋白酶K溶液，振荡混匀，65孵育Ih(过夜孵育更好)，期间每隔IOmin振荡混匀；(2)力口入500L的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),振荡抽提IOmin,室温
8、下以12,50OrPm离心10min；(3)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500FPm离心IOmin；(4)弃去上清液，用65预热的TE缓冲液溶解DNA；(5)小心吸取上清，加入200L氯仿：异戊醇(24:1),振荡抽提,室温下以1250OrPm离心15min；(6)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,5OOrPm离心IOmin：(7)弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤，离心Imin,晾干，溶于50LTE缓冲液中。5.2 DNA浓度和纯度的测定取lLDNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD26030值应在L71.9之间时，适宜于PCR扩增。5.3
9、 实时荧光PCR扩增反应体系总体积为25L,其中IOXPCR缓冲液5L,正反向引物(10molL)各lL,探针(10molL)lL,dNTPs(IOmolL)2L,TaqDNA聚合酶(2.5U)0.2L,DNA模板(10-100ngL)2L,用灭菌去离子水补足至总体积25L0真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。反应参数：50C2min；9515min；9515s,60CImin,40个循环。5.4 实验对照检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以己知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白
10、对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。6结果判断与表述6.1 质量控制以下条件有一条不满足时，结果视为无效：(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；(C)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值W35.0；(d)内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值V30.0。6.2 结果判定(a)如Ct值350,则判定为被检样品阳性；(b)如CI值为O.O,则判定为被检样品阴性；(C)如35.0VCt值V40.0,则重复试验-次。如再次扩增后Ct值仍为350VCt值V40.0,则判定被检样品可疑。6.3 结果表述结果为阳性者，结合产品标识，表述为“检出XX源性成分”。结果为阴性者，结合产品标识，表述为“未检出XX源性成分”。结果为可疑者，结合产品标识，表述为“XX源性成分可疑”。7防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。本方法负责起草单位：河北省食品检验研究院。验证单位：中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。
