绵羊补体片段3b受体C3bRelisa试剂盒说明书.docx

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1、绵羊补体片段3b受体(C3bR)elisa试剂盒说明书elisa试剂盒常见组成部分:1)酶和底物:在ELISA中ZUi常用的酶为HRP和ALP.2)抗体:在EIJSA中应用的抗体可分为多克隆抗体(多抗)和单克隆抗体(单抗)。3)抗原:在ELISA中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有三类,即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。4包被:将免疫活性物质(抗原或抗体)结合于固相载体上的过程称为包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纤维薄膜等;常用的方法有吸附法、化学交联法及亲和素生物素间接包被法5)固相载体:固相载体是ELISA中用以分离结合标记物和游离标记物的主要手段,应与各种免疫活性物

2、质有良好的结合性能并且不改变其免疫活性。常用的固相载体有聚苯乙烯塑料和硝酸纤维素膜。样本实验前准备:ELISA试剂盒液体样本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。(1)血清室温血液自然凝固10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。(2)血浆:应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合1020分钟后,离心20分钟左右(20003000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。(3)尿液:用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清。保存过程中如

3、有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。(4)细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清。(5)培养细胞检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反匏冻融或加入组织蛋白萃取试剂,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(20003000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。(6)组织标本切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4o用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持28的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),或组织蛋白

4、萃取试剂,用手工或匀浆器将标本匀浆化.离心20分钟左右(2000.3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。操作步骤1.标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在di一、第二孔中分别加标准品100,然后在di一、第二孔中加标准品稀释液50,混匀;然后从di一孔、第二孔中各取100分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50I,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50I弃掉,再各取50分别取50分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50,混匀后从第七、第八孔中加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,

5、混匀;混匀后从第五、第六孔中各分别取50I加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50,混匀后从第九第十孔中各取50I弃掉。(稀释后各孔加样量都为50I,浓度分别为180ngL,120ng/L,60ngL,30ng,15ngL)。2 .加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40,然后再加待测样品10I(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。3 .温育:用封板膜封板后置37C温育30分钟。4 .配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馆水30(48T的

6、20倍)倍稀释后备用。5 .洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。6 .加酶:每孔加入酶标试剂50,空白孔除外。7 .温育:操作同3。8 .洗涤:操作同5。9 .显色:每孔先加入显色剂A50,再加入显色剂B5OU,轻轻震荡混匀,379避光显色15分钟.10 .终止:每孔加终止液50Ul,终止反应(此时蓝色立转黄色)。11 .测定:以空白空调零,45Onm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟。注意事项1 .试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡1530分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。2

7、.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。3 .各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。4 .封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。5 .底物请避光保存。6 .严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.7 .所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。8 .本试剂不同批号组分不得混用。9 .如需代测或者样本暂时不测定,可立即低温冻存,温度越低越好,中间避免反复冻融,-20C以下可保存三个月70C以下可保存六个月。10 .试剂使用须知:11. (1)请参照相关法规、文献、MSDS等信息,理解并掌握好试剂的特性,再进行安全操作。12. (2)通常购买试剂时一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的话,更加注意其他保管和管理。13. (3)万一试剂操作者并非专业技术人员。必须在专业人士的指导监督下进行操作。对于使用后的废弃物,不要或者旧的试剂,应按照相关法律法规正当处理。14. (4)购买后,请务必确认标签上的注意事项;做好预防颠倒,摔坏的措施和管理体制;在使用前再次确认标签上的注意事项,做好必要的安全对策;对没有标明其危害特性、有害特性的,也要慎重地进行操作;必须带好防护用具,小心翼翼进行操作。

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