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1、第4章 固定化酶和固定化细胞,主要内容：4.4 固定化活细胞 4.5 酶催化反应器及其类型,4.4 固定化活细胞,利用胞内酶制作固定化酶时，先要把细胞破碎，才能将里面的酶提取出来，这就增加了工序和成本，且提取的酶往往不够稳定。因此人们设想直接固定那些含有所需胞内酶的细胞，并且就用这样的细胞来催化化学反应。20世纪70年代，在固定化酶的基础上科学家们研制成固定化细胞（Immobilized Cell），并且用于生产。70年代末，法国研究成功固定化细胞生产啤酒，80年代初我国居乃琥等用固定化细胞批量生产啤酒和酒精取得重要研究成果。,固定化细胞按其生理状态又可分为固定化死细胞和活细胞两大类。最初固定
2、化的细胞是死细胞或静止态细胞，只利用其酶活性，近年来发展到固定化活细胞。前者经固定化后，虽然整个细胞活力消失，但是，需要利用的“目的酶”仍保持催化活力；而后者经固定化后，细胞仍保存活性，能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。例如，琼脂包埋的酵母细胞数初时为106个/m3，在营养培养基里培养两天后，细胞数可达1091010个/m3。,与酶的固定化相比，固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，有效地利用游离细胞完整的酶系统和细胞膜的选择通透性，既具有固定化酶的优点，又具有其自身的优越性：,无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；可进行多
3、酶反应，且不需添加辅助因子，固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应，对于这种多酶系统，辅助因子再生容易；,固定化细胞的优越性,对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管其出现远远晚于固定化酶，但其应用范围比固定化酶更为广泛。,固定化细胞的优越性,当然，固定化细胞也有其自身的缺点，如：必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造
4、成底物渗透与扩散的障碍等。固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的，其制备方法也基本相同。固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和，其制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种。,4.5 酶催化反应器及其类型,以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为酶催化反应器，简称酶反应器。,4.5.1酶反应器的类型,酶反应器有两种类型：一类是直接用游离酶进行反应，即均相酶反应器；另一类是应用固定化酶进行的非均相酶反应器。均相酶反应能在批量式搅拌桶反应器或超滤膜反应器中进行，而非均相酶反应则可在多种反应器中进行，适用于连续催化反应，包括：连续流搅拌桶反应器、填充床反应器、流化床反应器、连续搅拌桶-超滤和循环式反应器
5、等。,4.5.2反应器的结构特点,这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料等食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。但是，常用于游离酶。,图4-2 批量式搅拌桶反应器,4.5.2.1 批量式搅拌桶反应器,这种反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同样的流速流出反应器。反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡，如图4-3。,4.5.2.2 连续流搅拌桶反应器(Continuous Flow Stirr
6、ed Tand Reactor，缩写CSTR),图4-3 连续流搅拌桶反应器,在理想的连续流搅拌桶反应器中，反应液混合良好，各部位的成分相同，并与流出液的组成也一致。CSTR的开放结构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度和调节pH，还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用CSTR有较高的转化率。,其缺点是，由搅拌产生的剪切力较大，易打碎磨损固定化酶颗粒。近来对此类型反应器进行了改良，就是将载有酶的圆片聚合物固定在搅拌轴上或者放置在与搅拌轴一起转动的金属网筐内，这样，既能保证反应液搅拌均匀，同时又不致损坏固定化酶。,4.5.2.3 填充床反应器(Packed Bed Reac
7、tor，缩写PBR),图4-4填充床反应器,填充床反应器又称固定床反应器（如图4-4）。可填充多向异性半透性中空纤维制成管状，内部填充酶膜、酶片等。在填充床反应器内，底物在一定方向上以恒定的速度通过固定化酶柱。若柱的横截面上每一点液体流动的速度完全相同，则可以认为反应器是在理想条件下作为活塞式流动反应器（Plug Flow Reactor，PFR）运转。由于流动方向上存在速度和温度梯度，在轴方向上存在底物的扩散，所以实际上总是不可能完全符合理想化的条件。,4.5.2.4 流化床反应器(Fluidzed Bed Reactor，缩写为FBR),图4-5 流化床反应器,流化床型反应器是种装有较小颗
8、粒的垂直塔式反应器。反应时，底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其结构如图4-5。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PFR的平推流型之间。由于反应器内混合程度高，因此，传热、传质情况良好。,4.5.2.5 连续搅拌桶-超滤反应器(CSTRUF),图4-6 连续搅拌桶-超滤反应器,CSTRUF结构是CSTR与超滤装置联用的酶膜反应器。在CSTR出口处设置一个超滤装置，通过超滤装置，酶可以循环使用。其结构如图5-6。该超滤器中的半透性超滤膜只允许小分子产物通过，不允许大分子酶和底物通过。因此，可以将小分子产物与大分子酶和底物
9、分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。,对这类反应器在技术上的可行性已得到了证实，例如进行纤维素的连续糖化、用-淀粉酶水解淀粉、用转化酶水解蔗糖和用青霉素酶把青霉素G转化成6-氨基青霉烷酸（6-APA）等生化过程。此外，还用于小分子产物（葡萄糖、麦芽糖）与大分子底物（淀粉、纤维素）的分离。,4.5.2.6 循环反应器（Recycle Reactor，RCR）,外循环反应器,内循环反应器,循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应。,4.5.3膜式反应器,膜式反应器是20世纪
10、70年代以来发展起来的一种新型反应器，它是利用膜的分离功能，同时完成反应和分离过程的一种反应器。,4.5.3.1 膜式反应器的类型根据酶的存在状态、相数、膜组件型式、膜材料类型、耦合方式、传质推动力等的不同，酶膜反应器有不同的分类方式。根据膜组件的型式不同，可把酶膜反应器分为板框式、螺旋卷式、管式和中空纤维式酶膜反应器。以下以螺旋卷膜式反应器和中空纤维膜式反应器为例来说明。,（1）螺旋卷膜式反应器 此反应器的螺旋结构是将含酶的膜片与支持材料交替地缠绕在中心棒上。所用的膜片一般是胶原蛋白；而支持材料则是一种称为凡克塞(vexar)的惰性聚合网状物。后者可以将相邻的两层含酶膜片分开来，以防止膜层相
11、互重叠，堵塞流道。把上述螺旋元件装进圆筒，筒两端加盖板，并安装进出口管，这样，就制成了螺旋卷膜式反应器。,含酶的膜是半透性膜，只允许小分子的底物和产物通过膜，而大分子酶则不能通过。该反应器有许多优点，例如，螺旋模型可将流体流动的单元分隔成许多独立空间，当底物溶液流经各个独立空间，并与酶接触时，均有相同的流体力学条件和停留时间，可改善接触效果，消除短路；另外，网状支持材料可以提高每一流动间隔的混合效果，加快物质传递。,（2）中空纤维膜式反应器 这类反应器是把酶结合于半透性的中空纤维上，中空纤维壁的内外结构一般是不同的。其内层是紧密光滑的半透性膜，有一定的分子截留值，可以截留大分子物质如酶，而允许
12、小分子物质通过。其外层是多孔海绵状的支持层。将酶固定于中空纤维的支持层中，然后，将许多含酶的中空纤维集中成束，装进圆筒内，筒两端封闭，并安装进出口管道，这样便制成了中空纤维膜式反应器。,用这种固定化酶填充的反应器可以提供较大的催化表面，其缺点是中空纤维的制造极为困难，难以保证纤维束内流体流动的均匀性，以及存在较大的物质传递阻力等。,4.5.3.2 膜式反应器的特点与一般反应器相比，酶膜反应器具有以下优点：（1）反应转化率不受化学平衡转化率的限制，这是酶膜反应器最为显著的特点之一。许多重要的化学反应都是平衡反应，使用传统的反应器无法突破平衡转化率的限制。而在膜反应器中，膜的选择透过性可使某些组分
13、(如产物)的连续脱除成为可能，从而可促使化学平衡发生移动，大大提高了反应的转化率。,（2）酶膜反应器可将目的产物分离出去，而酶可以重复利用，可实现连续操作，并有可能提高复杂反应的选择性。（3）膜作为酶的固定化载体可以使酶在类似生物膜的环境中高效发挥作用。,（4）可实现对流传质代替自由扩散，强化了传质速率，提高了反应速率。填充床与流化床反应器中，质量传递常会因分子扩散的制约而影响反应的进程，而酶膜反应器可通过对流扩散消除这种影响，从而使传质速率加快，反应速度提高。,（5）可以简化工艺流程和操作步骤，有可能使产物分离、反应物净化及化学反应等几个单元操作在一个膜反应器中进行，从而可以同时起到降低生产
14、成本和增加产量的作用。（6）膜作为相分离器和相接触器，避免了乳化和破乳等问题，也摆脱了液泛的限制。,但是膜反应器在使用过程中也存在着一些问题，这些问题严重制约了膜反应器的推广应用：由于膜的加工水平较低，膜孔分布与形态结构的均一性差，造成酶分子和小分子激活剂(金属离子或辅助因子等)的泄漏损失，需要在酶促反应过程中不断添加，既增加成本又造成操作过程的复杂化。,酶在膜表面的随机吸附引起酶空间构型的改变或活性位点的遮蔽，有些膜材料还可使酶中毒失活，从而降低或破坏酶的催化活性。酶分子在酶膜反应器中容易因湍流等原因而发生剪切失活。,有些情形下，由于产物分子在靠近膜面的位置逐渐积聚而形成凝胶层，造成酶膜反应
15、器中严重的产物抑制降低了生产效率。浓差极化和膜污染使酶膜反应器的传质速率和生产能力急剧下降，膜孔堵塞、膜厚增加使膜的结构形态发生不利变化，膜需要频繁地清洗或更换。,4.5.3.3 膜式反应器的应用酶膜反应器把酶促反应与膜的选择性物质传递有效地结合在一起，从而创造出有利的过程热力学和动力学，在生物、医药、化工、环境等领域得到了越来越广泛的应用。目前膜反应器的应用主要有：辅酶或辅助因子的再生、有机相酶催化、手性拆分与手性合成、反胶团中的酶催化、生物大分子的水解等。,其在食品中的应用如：透过果胶水解来降低果汁粘度；通过将乳糖转化为可以消化的糖类来降低牛奶和乳清中乳糖的含量；通过多酚化合物和花色素的转
16、化来进行白酒的处理；从牛奶产品中去除过氧化物等。酶膜反应器与传统反应器相比，具有许多现实意义。随着膜式反应器应用中一些问题的解决，膜式反应器将会得到越来越广泛的应用。,以上各种类型的酶反应器都可供使用，但并不存在一种通用的理想反应器。在酶促反应中，反应器的选择是一个十分重要的问题。在选择反应器时，除应考虑固定化酶的形状及稳定性、底物与产物性质和载体性质外，还需考虑生产成本、操作方式及反应器应用的可塑性等因素。在生产中，必须根据具体情况，针对系统的特点，选择和使用合适的反应器。,第5章 蛋白酶、溶菌酶（2学时）,主要内容：5.1 蛋白酶 5.2 溶菌酶,5.1蛋白酶,蛋白酶是食品工业中最重要的一
17、类酶。在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白质改性中都大量使用蛋白酶。人体消化道中存在的胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶使人体摄入的蛋白质水解成小分子肽和氨基酸。,5.1.1蛋白质的特异性要求,1、R1和R2基团的性质：胰凝乳蛋白酶仅能水解R1是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基的侧链的肽键；胰蛋白酶仅能水解R1是精氨酸或赖氨酸残基的侧链的肽键。胃蛋白酶和羧肽酶对R2基团具有特异性要求，如R2是苯丙氨酸残基的侧链，那么这两种酶能以最高速度水解肽键。,2、氨基酸构型：必须是L型的，天然蛋白质均属L型。3、底物分子大小：对于胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，底物分子大小不重要，如前述。,4、X和Y性质：X、Y可以是
18、-H、-OH，也可以继续衍生出去。（1）如果是肽链内切酶，在R1、R2能满足特异性要求的前提下，肽链就能裂开，显然X和Y必须继续衍生出去，内切酶活力才表现出最高。X、Y可以是氨基酸残基。（2）对于肽链端解酶的羧肽酶，要求底物中Y是一个-OH，其特异性对R2有严格要求。在X不是-H时，可表现高活力。（3）对于肽链端解酶的氨肽酶，要求底物中X是一个-H，优先选择Y不是-OH，特异性表现在R1上。,5、对肽键的要求：大多数蛋白酶不仅限于水解肽键，尚能作用于酰胺（-NH2）、酯（-COOR）、硫羟酸酯（-COSR）和异羟污酸（-CONHOH）胃蛋白酶和其它一些酸性蛋白酶对水解键有较高识别能力。如肽键脂
19、键，即使R2满足要求也不能作为底物。,5.1.2蛋白酶分类：,1、来源：（1）植物：菠萝、木瓜、无花果（2）动物：胃、胰蛋白酶、凝乳酶（胃）（3）微生物：1398枯草杆菌、3942栖土曲霉蛋白酶、放线菌蛋白酶2、最适作用条件：（1）中性蛋白酶：pH68 1398枯草杆菌、3942栖土曲霉蛋白酶（2）碱性蛋白酶：pH911 2709枯草杆菌蛋白酶（3）酸性蛋白酶：pH13 胃蛋白酶,3、对底物作用方式：（1）内肽酶：产物为脲、胨、多肽、低肽（2）外肽酶：羧肽酶：从以羧基末端 氨肽酶：从氨基末端4、根据酶活性部位：（1）丝氨酸蛋白酶（2）巯基蛋白酶（木瓜蛋白酶）（3）金属蛋白酶（4）酸性蛋白酶（凝
20、乳蛋白酶）,5.1.3木瓜蛋白酶：,其酶活性部位中含有巯基，属巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶存在于木瓜汁液中，分子量23900，至少有3个氨基酸残基存在于酶的活性部位，它们是Cys25（半胱）、His159（组）和Asp158（天冬）。当Cys25被氧化剂氧化或与重金属离子结合时，酶活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力。还原剂作用：从-S-S-SH，EDTA螯合重金属离子。,木瓜蛋白酶在pH5时，有良好稳定性，如pH11时酶很快失活，最适pH随底物改变。木瓜蛋白酶具有较高的耐热性，酶液在pH7和70度下加热30分钟，而使牛乳凝结的活力仅下降20%。木瓜蛋白酶对酯和酰胺类底
21、物表现出很高的活力。,5.1.4酸性蛋白酶：（重点介绍凝乳蛋白酶）,酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位。酶的活性部位含有一个或更多的羧基。有胃蛋白酶、凝乳酶凝乳酶是存在于哺乳期小牛第四胃中的蛋白酶，以无活性的酶原形式被分泌出来。随着小牛的长大，由摄取母乳改变成青草和谷物时，凝乳酶的数量下降，而胃蛋白酶的数量增加。,凝乳酶从无活性酶原转变成活性酶时经受了部分水解，分子量从36000下降到31000，pH5时酶原主要通过自身催化作用激活，而在pH2时，激活过程进行得非常快。凝乳酶在pH5.36.3最稳定，在pH3.54.5由于自我消化而失活。在中性和碱性范围
22、，无凝乳活力。,凝乳酶催化酪蛋白沉淀是干酪制造中非常重要的一步。原料乳杀菌添加发酵剂、凝乳酶、色素凝块形成排除乳清切块、搅拌、加热（CaCl20.01%）成型压榨腌渍发酵成熟上色挂蜡成品,5.1.5 蛋白酶水解蛋白质的苦味来源：,水解蛋白酶的苦味和蛋白质原有的氨基酸组成有关。特别是蛋白质中的疏水性氨基酸是导致蛋白质经水解后产生苦肽的重要原因。当蛋白质处于天然状态时，这些氨基酸埋藏在蛋白质结构的内部，因而对蛋白质的味道不会产生明显的影响。在酶水解过程中，小肽的数量将增加，从而暴露了这些疏水性氨基酸，当它们同味蕾相作用时就产生了苦味。,如果采取有控制的酶水解，使蛋白质的水解反应停止在某一个阶段，使
23、肽键具有足够的长度将疏水性氨基酸埋藏在它的结构内部，就能减少水解蛋白质的苦味。,5.1.6蛋白酶作为食品添加剂的应用：,1、作为肉类嫩化剂 多使用木瓜蛋白酶。从宰杀老龄的动物得到的肉类，经烧煮后口感粗糟和坚硬。肉类中存在一定数量的胶原蛋白质，胶原蛋白质中的交联数目和强度随动物年龄的增加而提高。木瓜蛋白酶作用效果从肉类感官评定和剪切力测定中可以看出。,适合于配制肉类嫩化剂的蛋白酶必须具有较高的耐热性。这是因为嫩化剂的作用主要发生在当肉类被烧煮，温度逐渐升高，而酶尚未失活之前的这个阶段。烧煮导致肉类结缔组织中胶原蛋白质和强性蛋白质变性，而蛋白酶较易作用于变性的胶原蛋白质和弹性蛋白质。木瓜蛋白酶在6
24、065度时使胶原蛋白质增溶的速度最快。,2、绿茶饮料浑浊：浑浊物质主要是由蛋白质（1565%）和多酚类化合物（1035%），通称茶乳酪（creamy）,是绿茶饮料生产中的关键，添加木瓜蛋白酶除去绿茶浸提液中的蛋白质，对稳定绿茶饮料十分有利。,5.2 溶菌酶,溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)，从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜
25、、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。,在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。,5.2.1 溶菌酶的种类,溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。,1937年由Ab
26、raham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类。,5.2.1.1 动物源溶菌酶动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50，化学性质稳定，pH在1.211.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在47范围内100处理1min仍有近100%的活力，在210条件下加热1.5h仍具有活性。,鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细
27、菌，但对G-细菌不起作用。研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。,人溶菌酶分子量为14600单位，对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性远低于人溶菌酶。,5.2.1.2 植物源溶菌酶目前发现含溶菌酶的植物有近170种，在木瓜、无花果、大麦等植物中均已分离出溶菌酶。植物源
28、溶菌酶分子量较大，约为2400029000单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。,5.2.1.3 微生物源溶菌酶上世纪60年代从微生物中分离出溶菌酶，根据其作用对象分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它破坏细菌细胞壁肽聚糖中-(1，4)糖苷键；酰胺酶，它催化裂解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。,现在研究发现，细菌细胞壁溶菌酶的抗菌活性不仅表现在其分解细菌细胞壁方面，当酶受到不可逆抑制
29、后，它仍然显示出抗菌效应；不同来源的细菌细胞壁溶菌酶有不同的抗菌范围，并对不同类型的肽聚糖有特异性。,真菌细胞壁溶菌酶包括几丁质酶和-葡聚糖酶。抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶，首先是在植物中发现，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体，后来人们在链霉菌属、杆菌和大多数真菌也发现该酶，真菌几丁质酶与植物几丁质酶相似。几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程，由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。,-葡聚糖酶(-glucanases)是另一类真菌细胞壁溶菌酶，包括-(1，3)葡聚糖酶，-(1，6)
30、葡聚糖酶和甘露聚糖酶等，主要用于分解酵母细胞的细胞壁。如-(1，3)葡聚糖酶主要作用是它能水解-(1，3)糖苷键，还可以对几丁质降解真菌细胞壁起到显著的协同作用，将纯化的几丁质酶和-葡聚糖酶合用，其抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera)的作用能够提高10倍。,5.2.2 溶菌酶的性质及作用机理,溶菌酶纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚。其活性受以下因素影响。,5.2.2.1 温度对溶菌酶活性的影响Weaver等发现在60以上牛乳中的溶菌酶活性下降。Hayase等发现溶菌酶通过二硫键聚合，180时聚合和降解同时进行，当200时肽键
31、的断裂和重组发生，聚合和降解变得更为剧烈。Frasco等用红外光谱研究了溶菌酶的热变性机理，发现它是和水结构密切相关的。其它外侧非极性氨基酸残基对变性无重要影响，从外侧极性氨基酸游离出的水在其始变性过程中起重要作用，水进入内部肽-肽键中，使蛋白质膨胀和伸展。,5.2.2.2 pH对溶菌酶活性的影响 溶菌酶在酸性pH下是稳定的，此时100的加热对溶菌酶仅有很小的活性损失。Matsuoka等报道pH4.5(100、3min)、pH5.29(100，30min)的加热对溶菌酶是稳定的。Beychok等报道溶菌酶在pH5.5最为稳定。,5.2.2.3 化学物质对溶菌酶的影响Back等研究表明糖和聚烯烃
32、类能增加溶菌酶的热稳定性，Hidaka等发现NaCl对溶菌酶也有抗热变性作用。同时Kravchenko等发现盐溶液的存在对溶菌酶的活性是十分必要的，Chang的研究也发现溶菌酶的活性在低盐浓度时和离子强度密切相关的，在高盐浓度时溶菌酶的活性受到抑制，阳离子的价态越高则其抑制作用越强。Yashitake等发现具有-COOH和-SH3OH基的多糖对溶菌酶活性有抑制作用。,5.2.2.4 加工过程对溶菌酶活性的影响在一个冷冻干燥的模拟体系中溶菌酶有聚合、生物活性损失和其它化学变化。溶菌酶和过氧亚油酸的反应生成了二聚和高聚体；多聚是因为随水活性增加共价键交联度、蛋白质不溶性和酶活性损失增加引起的。,5
33、.2.2.5 络合作用对溶菌酶活性的影响溶菌酶可和许多物质形成络合物导致其活性丧失。等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活性，脱水整蛋仅保留部分溶菌酶活性，蛋黄在pH6.2磷酸盐缓冲液中使纯溶菌酶失活。研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。,5.2.3 溶菌酶的抗菌机理,细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)及N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖(Peptidoycan)。,肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，它是由NAM、NAG和肽“尾
34、”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过-l，4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。,溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的l位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的-l，4糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最后细胞溶解死亡。对于G+细菌与G-细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽
35、聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌作用不大。,5.2.4溶菌酶在食品上的应用,5.2.4.1 溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度(通常为0.05%)的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐保鲜的作用。,5.2.4.2 用于新鲜海产品和水产品的保鲜一些新鲜海产品和水产品(如：虾、蛤蜊肉等)在0.05%的溶酶菌和3%的食盐溶液中浸渍5min后，沥去水分，进行常温或冷藏储存，均可延长其储存期。,5.2.4.3 在乳制品中的应用溶菌酶在人乳中含量最高，是
36、牛乳的3000倍，是山羊乳的1600倍，溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白，在人工喂养或食用母乳不足的婴儿食品中添加溶菌酶是非常必要的。因为溶菌酶是人体的一种非特异性免疫因子，对杀死肠道腐败球菌有特殊作用。溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双岐杆菌增殖，它可以促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，有利于婴儿消化吸收；,溶菌酶也可以促进人工喂养婴儿肠道细菌群的正常化；它能够加强对血清灭菌蛋白，r-球蛋白等体内防御因子，以增加对感染的抵抗力，特别是对早产婴儿有预防体重减轻，预防消化器官疾病，增加体重的功效。所以溶菌酶是婴儿食品、婴儿配方奶粉等的良好添加剂。,在奶酪生产中使用溶菌酶，特别是
37、中期、长期熟化奶酪中，可以防止奶酪的后期起泡，以及奶酪风味变化，而且不影响在老化过程中的奶酪基液。溶菌酶不仅对乳酸菌生长很有利，而且还能抑制污染菌引起的酪酸发酵，这种特性为一般防腐剂不能达到的。溶菌酶还可用于乳制品防腐，尤其适用于巴氏杀菌奶，能有效地延长其保存期，由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬时杀菌奶。,5.2.4.4 在糕点和饮料上的应用在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加人溶菌酶也可起到一定的防腐作用。在pH6.07.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。在低度酒方面的应用是日本已成功地使用鸡蛋蛋清溶菌酶代替水杨酸作
38、为防腐剂用于清酒的防腐，其加入量为15mg/kg。此外溶菌酶还可作为料酒和葡萄酒的防腐剂和澄清剂，使用量为0.005%0.05%。,5.2.4.5 用于制备细胞浸提物酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分，它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的方法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。也可以用溶菌酶从酵母细胞中制备呈味物质，如有些溶菌酶中除了含有溶菌酶的活性外，还可以含有能分解酵母细胞中的核酸为肌苷酸和鸟苷酸的单核酸类的呈味物质。,5.2.4.6 溶菌酶在食品包装工业中的应用将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产出有抗菌功效的食品包装材料，以达到抗菌保鲜功能。目前许多肉制品软包装都需要经过高温灭菌处理。经过处理的肉制品脆性变差甚至产生蒸煮味。如果在产品真空包装前添加一定量的溶菌酶(1%3%)，然后巴氏杀菌(80100，2530min)，可获得很好的保鲜效果。,5.2.4.7 在功能性食品中的应用溶菌酶是一种无毒、无害的高盐基蛋白质，且具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血作用，有组织再生作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。,谢 谢！,
