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1、Chapter 4 DNA replication,Key notes,Semi-conservative mechanismReplicons,origins and terminiSemi-discontinuous replicationRNA priming,Basic characters of DNA replication(基本特征）The enzyme of DNA replication（酶学）The process of DNA replication（过程）Reverse transcription（反转录）,DNA复制的基本特征,Template,四种dATP,dGTP
2、,dCTP,dTTP为前体，二价金属离子Mg2+(或Mn2+)，按照碱基互补配对规则复制产生子链解链复制方式为半保留复制（semi-conservative replication）需要引物（primer）复制方向总是5-3复制子（replicon)复制的方向：一般为双向 半不连续性：冈崎片断(Okazaki fragment)具有高度的忠实性,图4-1 DNA复制可能的三种方式以及Meselson和Stahl实验的可能结果,半保留复制,1958年，Meselson 和Stahl首次用实验证实了DNA的半保留复制。用普通培养基（14N）培养15N标记的大肠杆菌。用CsCl密度梯度离心法分析DN
3、A。抽提子一代DNA分子。,图4-2 Meselson 和Stahl实验的实际结果,Herbert Taylor 在植物根尖细胞中使用放射自显影证明，真核细胞DNA的复制方式也是半保留。,复制子（replicon),复制子:基因组中能单独进行复制的单位。每个起始点到终止点的区域为一个复制子。起始点（origin of replication,ori):原核生物DNA分子中只有一个，长度 200bp左右。大肠杆菌ori C有245 bp。真核生物有多个复制起始点。三个特征：a）由多个短的重复序列组成；b)富含AT；c)能够被特定的复制起始区结合蛋白识别。终点（ter）：通常不固定。,图4-3 证
4、明DNA复制的方向始终是53的末端终止实验,图4-10 DNA的半不连续复制,Okazaki fragmentLeading strandLagging strand,DNA复制所需要酶和蛋白质,DNA polymerase(DNA pol)DNA 解链酶(helicase)：水解ATP获能解开双链DNA单链结合蛋白(single-stranded binding protein,SSB),DNA引发酶(primase)：RNA引物合成DNA 拓扑异构酶(topoisomerase)：与超螺旋松驰有关，改变DNA拓扑性质，松驰超螺旋，有利于复制叉的前进，有型和型，原核、真核中均有。DNA连接酶
5、(ligase)端粒酶(telomerase),原核生物DNA聚合酶（DNA polymerase,DNA pol),1957年Kornberg首先从大肠杆菌提取DNA pol：聚合作用：5 33 5外切酶活性：校对功能5 3外切酶活性：引物切除、损伤修复主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复DNA pol I具有的聚合酶和5-外切酶活性的配合使用可导致本来一条链带有切口的DNA分子发生切口平移(nick translation)。目前已在E.coli中发现DNA pol、和。,DNA polI催化的缺口平移,DNA pol是单一肽链的大分子,由pol A编码，分子量为1
6、09kD,二级结构以-螺旋为主。用特异的蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶subtilisin或胰蛋白酶trpsin）处理，可把DNA pol水解为两个片段。小片段：323个氨基酸残基，5 3外切酶活性大片段或称Klenow片段：605个氨基酸残基，DNA聚合酶活性和3 5外切酶活性,图4-13 DNA pol的聚合和校对,finger,thumb,palm,DNA pol：5 3聚合酶活性及3 5外切核酸酶活性，90kDa，由pol B基因编码。DNA pol:由10 个亚基组成，分别为、及。是原核生物体内真正起复制作用的酶，主要有核心酶和全酶两种形式。全酶由核心酶、滑动钳(sliding clamp)
7、和钳载复合物(clamp-loading complex)组成。核心酶：由、组成。亚基：由pol C(也称dna E)基因编码，5 3聚合酶活性亚基:由dna Q基因编码，3 5外切酶,校对和编辑为装配必须Pol III：由核心酶和亚基组成。体内Pol III形成二聚体，分别负责前导链和后随链的复制。钳载复合物：由、及亚基组成，具有ATP酶活性，负责滑动钳的装载。滑动钳：由两个亚基组成，为环绕DNA模板而成的环状六角星结构。,图4-14 E.coli DNA polIII全酶的结构模型,DNA pol 和 1999年被发现，属于易错的聚合酶，参与DNA的修复合成。DNA pol 与DNA po
8、l II在细菌生长的稳定期被诱导表达，一起修复该阶段DNA损伤DNA pol 在细菌进行SOS反应时被诱导合成。由1个Umu C和2个Umu D组成。,真核生物DNA聚合酶,目前发现超过15种，最重要的是、和五种。、及四种，都有5 3聚合功能。及、参与核染色体DNA复制；：链合成的引发，和：链的延长，具3-外切酶活性，校对功能。PCNA(proliferating cell nuclear antigen)为的辅助蛋白，三个亚基组成滑动钳，以提高的进行性。：两个结构域，N-端为5-脱氧核糖磷酸酶和与单链DNA结合的活性；C-端具聚合酶活性。参与DNA损伤的修复，增补DNA链上短的空隙。：线粒体
9、DNA复制和损伤修复，具聚合酶、3-外切酶和5-脱氧核糖磷酸酶活性。,端粒与端粒酶(telomerase),Telomere:真核生物线性染色体3-末端的一种特殊结构，由蛋白质和DNA组成。核苷酸重复序列富含G，和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列，长度515kb。作用：保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解以及不正常的融合和重组；解决染色体复制时末端丢失问题。,Telomerase:由RNA和蛋白质组成的酶。兼有模板和逆转录酶两方面的作用。1995年，Feng等克隆了人类端粒酶RNA基因，长约450个碱基的RNA序列中有一段长11个核苷酸的区域（5-CUAA
10、CCCUAAC-3）与人的端粒序列（TTAGGG）n互补。端粒酶蛋白质的分离：四膜虫端粒酶两个多肽成分p80和p95。,图4-27 端粒酶的作用机理,端粒与衰老,实验：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。结论：细胞的衰老是由端粒驱动的。体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。,可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为“端粒钟”，或有丝分裂钟 或“生命的时钟”，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短，具
11、有无限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在，而体细胞则很难检测到端粒酶的活性，端粒的长度也短得多。,端粒酶与肿瘤,人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。体细胞的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡，而肿瘤端粒酶的激活可以维持端粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。,端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没有影响。人端粒酶逆转录酶(human tel
12、omerase reverse transcription)：具有肿瘤特异性，因此hTERT启动子可以用于靶向治疗基因的表达。,Figure 1 Schematic diagram of adeno-associated virus(AAV).(a)The structure of the wild-type AAV.(b)The gene-delivery vector based on AAV.The viral genome is replaced by an expression cassette,which usually consists of a promoter,transge
13、ne and polyA(pA)tail.(c)Diagram of AAV-hTERT-hIFN-.(d)Diagram of the two ORF rep and cap.Cap encodes three capsid proteins VP1,VP2 and VP3.The arrows mark sites of the specific ligands insertion(numbers are the amino acid positions N-terminal of the insertion).,Chin Sci Bulletin,2007,52:1590-1599.,O
14、ncogene(2004)23,457-464,DNA的复制的过程,DNA复制过程的三个阶段DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及引发体的形成。DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接冈崎片段。DNA复制的终止阶段。,（一）DNA复制的起始阶段复制是从DNA分子上的特定部位开始的，即复制起始点(origin of replication)常用ori或o表示，复制的基本单位为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有多个复制子。,DNA复制起始点的结构特性大肠杆菌Ori由
15、422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)。有些生物复制起始点Ori是富含AT的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。,图4-28 E.coli的OriC结构,(一)DNA复制的起始E.Coli DNA复制起始包括对其复制起始区OriC的识别，以及引发体(primosome)的形成。DNA双螺旋的解旋由多种酶来完成的DNA解链酶：水解ATP获能解开双链DNA单链结合蛋白（SSB蛋白）：保持单链结构引发酶(RNA聚合酶)：合成RNA引物随从链是由引发体来完成的,图4-29 E.coli DNA复制
16、过程中引发体的形成,（二）DNA链的延长复制的延伸在复制体(replisome)内进行。DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将四种dNTP聚合成DNA的过程。过程：复制体的形成 前导链合成 后随链合成 后随链合成与前导链合成之间的协调。,图4-30 E.coli DNA复制过程中复制体的形成,图4-31 E.coli DNA复制的延伸,（三）DNA复制的终止阶段 E.coli DNA具有复制终止位点Ter 位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus(terminator utilization substance)，通过阻止Dna B解链酶(Helicase)的解链
17、活性而终止复制。,图4-32 E.coli DNA复制终止区的结构,其它环状DNA分子的复制,1、复制:首先由J.Carins 从大肠杆菌中观察到,又称为 Carins复制。2、滚环复制（rolling circle replication)：噬菌体(X174和M13)和一些小质粒；真核生物如两栖卵母细胞的rDNA和哺乳动物的DHFR(二氢叶酸还原酶)基因。3、D环复制（D loop replication)：线粒体和叶绿体DNA和少数病毒如腺病毒DNA的复制,滚环复制,D环复制图,真核与原核生物DNA复制的特点(差别)染色质和核小体结构对DNA复制的影响复制叉移动的速度远远低于原核细胞真核生
18、物是多点复制，具多个复制起始区，原核生物是单点复制。冈崎片段的长度短于原核细胞复制严格限制在细胞周期的S期真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。真核生物线性DNA末端具有端粒结构。,逆转录（reverse transcription),逆转录：以RNA为模板合成DNA，存在于逆转录病毒以及原核生物和真核生物如端粒酶的延长等。逆转录酶（reverse transcription)逆转录病毒的基因组复制过程乙肝病毒基因组的复制,图4-40（1）逆转录病毒的结构,图4-40（2）逆转录病毒的详细结构,图4-41 逆转录病毒基因组的结
19、构,图4-42 HIV的生活史,图4-43 HIV与宿主细胞的附着,图4-44 逆转录病毒基因组逆转录的详细过程,图4-45 逆转录病毒基因组的逆转录结果,图4-46 原病毒DNA进入细胞核的机理,逆转录酶（reverse transcription),1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA。Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。,Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物
20、。1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。,逆转录酶是一种多功能酶：1、RNA指导的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA杂交体上的RNA3、DNA指导的DNA聚合酶活性：合成互补DNA。4、没有35外切酶活性。,特点：含有Zn2+DNA合成反应要求有模板和引物。需适当浓度的二价阳离子（Mg2+、Mn2+）5 3,乙肝病毒基因组的复制,其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现，其DNA聚合酶也是一种逆转录酶。,逆转录病毒：RNA DNA RNA乙肝病毒：DNARNA DNA,实验室cDNA的合成-特定基因的获得,常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mRNA，经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT；来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。,Topic,1 cell cycle2 apoptosis 3 micro RNA4 transcription5 translation6 telomerase,
