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1、大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范（征求意见稿）编制说明大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范编制组二。二三年八月项目名称：大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范项目统一编号：20231140承担单位：北京市生态环境监测中心、中科院生态环境研究中心1标准基本情况11.1 任务来源11.2 起草单位和主要起草人12制定标准的必要性和意义12.1 管理支撑12.2 必要性和意义23主要工作过程33.1 查阅国内外标准及文献43.2 前期研究成果53.3 标准技术路线64编制原则和编制依据74.1 编制原则74.2 编制依据74.3 与现行法律、法规、标准的关系85主要条款的说明95.1
2、文件内容框架95.2 主要技术指标、参数、实验验证的论述115.3 方法应用276重大意见分歧的处理依据和结果337与国内外同类标准水平的对比情况348作为推荐性标准或者强制性标准的建议及其理由349实施标准的措施3510其他应说明的事项351标准基本情况1.1 任务来源2023年1月北京市市场监督管理局发布了北京市市场监督管理局关于印发2023年北京市地方标准制修订项目计划的通知(京市监发(2023)4号)，大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范列入2023年北京市地方标准制修订项目，项目编号：20231140o项目类别为一类，标准性质为推荐性。1.2 起草单位和主要起草人大型底栖无脊椎动
3、物环境DNA监测技术规范行业主管部门为北京市生态环境局，主要起草单位为北京市生态环境监测中心、中国科学院生态环境研究中心。主要起草人：常淼、杜泽瑞、沈秀娥、孙成华、陈圆圆、刘康、任帅、晁晶迪、马秋月、贺鑫、战爱斌、熊薇、陈义永。2制定标准的必要性和意义2.1 管理支撑拓展水生态监测能力，支撑水生态环境管理需求工作需要。生态环境部发布的生态环境监测规划纲要(2020-2035年)中提出“地表水监测要逐步实现水质监测向水生态监测的系统转变，建立以流域为单元的水生态监测指标体系和评价体系”。“十四五”重点流域水生态环境保护规划要求在长江、辽河、海河、松花江等流域开展水生生物环境DNA监测试点。生态环
4、境部发布的内陆大型底栖无脊椎动物多样性调查与评估技术规定要求在编制大型底栖无脊椎动物物种名录时要附上凭证，包括照片、DNA序列等。2020年农业农村部发布长江十年禁渔计划，以空前严格的措施实施禁渔。而传统的形态学鉴定损伤性(通常是致死性)的取样方式对所研究的生物群落造成了破坏，违背了保护生物多样性的初衷。现行的禁渔政策也不允许破坏性样品采集。北京市生态环境局印发北京市“十四五”时期生态环境监测规划要求拓展水生态监测，开展水体底栖生物在水生态补偿领域的应用研究，研究水环境生态标识物监测指标，探索开展水生生物自动识别、水生态流量监测，为水生态监测指标纳入本市水生态环境区域补偿监测体系奠定基础。提升
5、水生态监测能力，探索应用环境DNA宏条形码生物多样性技术，开展水生生物的分子生物学快速鉴定技术研究，初步构建本地化水生生物DNA条形码数据库。2.2 必要性和意义现行标准和技术规范不足以支撑北京市水生态环境管理工作需要。大型底栖无脊椎动物形态学鉴定监测需要借助专业设备，不利于开展大规模的现场调查。大型底栖无脊椎动物采样需要借助专业的采泥器、踢网、D形网、索伯网、人工基质篮式采样器和十字采样器等，点位选择及采样人员的经验直接影响大型底栖无脊椎动物样品的采样和物种鉴定质量。这种损伤性（通常是致死性）的取样方式对所研究的生物群落造成了破坏，违背了保护生物多样性的初衷。此外，随着监测技术的发展和环境管
6、理需求的变化，使用形态学鉴定的方法进行水生物种多样性监测逐渐暴露出很多局限性：（1）采样要求高，监测效率低。一次采样难以全面准确的采集到合格的样品，造成样品代表性差；（2）分类鉴定过于依赖专家的经验，对研究人员的经验要求较高，鉴定与分类结果的正确性缺乏依据，质控困难；（3）在生活史早期阶段的大型底栖无脊椎动物及高度近缘的大型底栖无脊椎动物类群往往难以辨别，特定发育阶段及不同性别的样品往往难以辨别，影响鉴定结果的准确性等。传统监测方法的局限性使其难以适应目前水质监测要求的高频率、大规模、高要求的监测和管理需求。因此，亟需建立高灵敏度、高准确度、高效率、代表性更好的新型水生生物监测技术和方法。环境
7、DNA（environmentalDNA,环境DNA）是从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含动植物脱落的细胞或游离的DNAo环境DNA监测方法通过高通量测序技术获取样品中生物物种组成，能够快速、准确、大规模地得到生物群落结构组成和多样性信息，极大的拓展了生物多样性调查方法,现已被广泛应用于水生态环境的生物多样性监测中。相对于传统的野外调查监测方法，环境DNA技术具有其独特的优势：（1）采样方法简单，省时省力。相对于传统的采样方法，采集水样耗时少、成本低。（2）无损伤采样。相对于传统的捕获式采样，环境DNA技术只需要采集生物栖息地的水样，并不会危害到目标物种或者采集区域内的其他
8、物种，对采样点周围的生态系统干扰较少。（3）不依赖动物样本。克服了传统的动物野外调查方法对动物样品自身的依赖性，避免了未遇见或未采集样本而造成对物种多样性及其分布状况的低估或误判。（4）采样受限小。由于环境DNA主要采集水样，与传统的调查监测方法相比，在采样环节对环境要求低，可以最大限度地降低因天气状况、水位、物候等环境条件变化对采样的影响和限制。（5）灵敏度高，样品代表性强。即使在物种密度很低的情况下也能准确检测到目标物种的存在。研究表明对于监测淡水水生生物，尤其是外来入侵或者濒危乃至稀有动物，其灵敏度要高于传统的监测方法。（6）快速和高效检测群落多样性。结合高通量测序技术的环境DNA宏条形
9、码方法可以在短时间内对混合的环境样品包含的所有物种进行识别和检测，具有大尺度、大样本生物多样性监测的潜力。（7）流程的标准化程度高，便于质量控制。有利于制定规范的鉴定标准，克服了传统方法受样品条件限制、操作者实践经验和专业知识等限制。基于此，环境DNA技术已成为高灵敏度、高准确度、高效率、代表性更好和标准化的新一代生物多样性监测方法。环境DNA监测集成了样品采集、环境DNA提取、PCR扩增、测序、生物信息学分析等一系列操作的综合技术体系，监测的结果也会受到诸多方面的影响，规范标准的操作流程是成功和准确开展环境DNA监测的关键。大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范的制定将为在全市范围内进行大
10、型底栖无脊椎动物环境DNA监测提供统一的技术标准，满足国家与北京市对于拓展水生态监测，提升水生态监测能力的技术需求。3主要工作过程北京市生态环境监测中心接到北京市地方标准制修订项目计划任务后，于2022年成立了标准编制组，编制组由从事大型底栖无脊椎动物监测和环境DNA监测相关技术人员组成。2022年1月5月，梳理完成了2020年8月2021年12月北京市典型水体底栖无脊椎动物环境DNA监测结果，整理分析北京五大水系60余个点位底栖无脊椎动物名录和构建的98种北京市本地大型底栖无脊椎动物条形码数据库。总结环境DNA监测底栖无脊椎动物发现的问题及规律，提出大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范研
11、究总体技术路线，建立科学可行的基于环境DNA技术的北京市典型水体底栖无脊椎动物监测的程序、方法。2022年6月12月，完成了方法技术参数研究和论证工作，编制完成了环境DNA技术的淡水底栖无脊椎动物监测技术规范申报书和标准文本草案，申报立项。开展方法应用和相关技术的实际验证工作，继续补充北京市本地大型底栖无脊椎动物条形码数据库，累计154种。2023年1月，标准获批立项，召开了专家研讨会，会上就大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范的采样介质、引物等核心技术问题进行了专家质询和讨论。2023年2月3月，开展了方法核心参数验证实验和实际样品采集分析，继续修改完善标准文本草案和编制说明。2023年
12、4月5月，召开了两次专家咨询会，专家建议1、重点关注深水型湖库（密云水库）开展不同深度水样的系统研究，确定深水型湖库环境DNA采样方式。2、增加阳性样品验证实验。2023年6月7月，根据专家意见，补充采集了深水型湖库样品，补充了阳性样品验证实验，修改完善了地标草案文本及编制说明，2023年7月9月，召开专家研讨会，汇总专家会意见对标准进行修改，编制组召开内部讨论会，完善了本标准的内容，形成大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范（征求意见稿）及编制说明。3.1 查阅国内外标准及文献3.1.1 国内应用进展2019年至今，中国环境总站和各省市级监测站陆续开展了基于环境DNA的水生生物监测试点应用
13、O中国环境总站在2021年启动了长江流域鱼类环境DNA试点监测、通量试点监测及水生生物样品采集项目。北京市等省级环境监测机构相继建立环境DNA分子生物学实验室，购置了相关仪器设备，建立了环境DNA监测能力开展试点监测。3.1.2 国外应用进展环境DNA技术最早在2008年由美国开始探索研究，环境DNA最初被用来监测水生生态系统的生物入侵。如美国牛蛙(FiCetoIaetal,2008)、亚洲鲤鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)(Jerdeetal,2013)大西洋Sl(Cyprinuscarpio)(Takaharaetal,2012)水生腹足类(PotamOPyrgU
14、Santipodarum)(Goldbergetal,2013)、克氏原螯虾(PrOCambarUSClarkii)(TregUieretal,2014)等入侵物种的监测，上述研究证实了环境DNA技术的可行性。综上所述，环境DNA监测方法在国内外正处在快速发展阶段，随着方法技术发展和标准化，未来将为水生生物调查监测和水生态环境评价提供了重要的技术支撑。3.2 前期研究成果北京市生态环境监测中心20世纪70年代末至本世纪初对北京市水源地、游览水域、市区下游主要河道和主要湖泊水库进行大型底栖无脊椎动物群落监测。编写了国控点及重点水域实施生物监测方法的可行性、昆明湖及”六海”部分水域水生生物群落调查
15、报告等技术报告。先后承担过北京市生态环境局组织实施的密云水库水质保护技术研究课题、水利工程等人为活动对北京市部分水域水生生物群落影响等多项课题。2020年开始联合中科院生态环境研究中心实施北京市五大水系水生生物调查监测与水生态环境状况评价、基于环境DNA技术的北京市典型水体水生生物多样性监测和水生态环境状况评估、水环境生态监测与评价项目基于环境DNA水生生物多样性监测及评估项目。每年选择不同水体类型(河流湖库)，在山区、平原布设60余个点位开展环境DNA水生生物监测，至今已开展7轮调查监测。前期开展的常规大型底栖无脊椎动物监测和调查工作，积累了大量基础数据，掌握了北京市各个流域各类水体中大型底
16、栖无脊椎动物分布状况，验证了环境DNA布点采样方法、选择了适合北京市流域大型底栖无脊椎动物监测的通用引物，并开展了基于环境DNA技术的大型底栖无脊椎动物水生态状况评估工作。截至目前，已取得的成果包括两部分：（1）在北京市五大水系采集了大型底栖无脊椎动物样品，获得了北京地区大型底栖无脊椎动物基础监测数据。构建了北京地区典型水域的大型底栖无脊椎动物条形码数据库，包括环节动物门，节肢动物门，软体动物门共154个物种。通过样品采集、清理、鉴定、浸制，共得到大型生物标本50余种，包含虾类，贝类和水生昆虫。（2）基于环境DNA技术获得了2020-2023年北京市五大水系60余个点位大型底栖无脊椎动物多样性
17、和群落组成。掌握了大型底栖无脊椎动物季节变化和空间分布规律，不同类型水体优势种和北京市大型底栖无脊椎动物物种名录。同时开展了基于环境DNA的水生态环境状况评价。3.3 标准技术路线2020年起至今，北京市生态环境监测中心联合中国科学院生态环境研究中心在北京市五大水系60余个点位开展了7轮次的大型底栖无脊椎动物形态学和环境DNA监测。在实际工作中优化监测方法技术参数，展开多次交流讨论，于2022年9月完成了环境DNA技术的淡水底栖无脊椎动物监测技术规范项目申报书和标准文本草案。经过主管部门北京市生态环境局审核后，报北京市市场管理局申请立项为一类项目。2023年1月大型底栖无脊椎动物环境DNA监测
18、技术规范获批立项，标准编制组多次讨论修改标准技术路线。编制组根据专家意见，进一步修改完善标准文本形成征求意见稿。2023年8月北京市生态环境监测中心组织召开了大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范专家研讨会。标准制定技术路线见图K图1标准技术路线4编制原则和编制依据4.1 编制原则本标准按照GBl.l-2020标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的规定进行编写。以国家和北京市现行生态环境相关法律、法规、政策和规划中水生生物监测的相关要求为依据，符合各项法规要求，与现行相关标准协调衔接,满足水生态环境管理要求。规范编制基本原则如下：（1）充分考虑北京市实际情况，与已颁布的各有关法规、标准内
19、容不矛盾。（2）总结现有文献资料及大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术的方法验证和实际应用的基础上，规范内容与指标明确。（3）可操作性强，具有普遍适用性，易于推广使用。4.2 编制依据本标准制定过程中参照的主要标准：GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T35537高通量基因测序结果评价要求GB/T35890高通量测序数据序列格式规范GB/T40226环境微生物宏基因组检测高通量测序法HJ91.2地表水环境质量监测技术规范HJ168环境监测分析方法标准制订技术导则HJ494水质采样技术指导HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物HJ1295水生态监测技术指南河流水生生
20、物监测与评价(试行)HJ1296水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价(试行)DB11/T1368实验室危险废物污染防治技术规范4.3 与现行法律、法规、标准的关系4.3.1 国内标准方法近年来随着测序技术的发展，已发布的标准有高通量基因测序技术规程(GB/T30989-2014)、高通量基因测序结果评价要求(GB/T35537-2017)高通量测序数据序列格式规范(GB/T35890-2018)、环境微生物宏基因组检测高通量测序法(GB/T40226-2021)详细规定了DNA提取、PCR扩增、文库构建和测序、数据分析等环节的技术要求。环境DNA(EnVironmentaIDNA,e
21、DNA)技术起源于微生物领域，最早被用于分离纯化环境中微生物的DNA,随后逐渐被应用被用于监测水生生物。目前，国内已发布水生生物环境DNA监测相关标准有中国环境科学学会团体标准淡水生物监测环境DNA宏条形码法(T/CSES81-2023)O规定了利用环境DNA宏条形码技术监测淡水生物的方法和质量控制与质量保证。适用于基于DNA序列相似性的淡水生物多类群监测，包括浮游植物、着生藻类、水生维管束植物、浮游动物、大型底栖无脊椎动物和鱼类等。北京市地方标准鱼类贝类环境DNA识别技术规范(DB11420232022)规定了鱼类贝类环境DNA(eDNA)识别的对象、技术方法、采集和实验分析等技术要求。正在
22、征求意见的标准有辽宁省地方标准水质DNA条形码鉴定大型底栖无脊椎动物，江苏省地方标准淡水生物环境DNA监测技术方法。4.3.2 国外标准方法国际上各国已经制定基于环境DNA的生物监测的标准、指南、手册。2015年由美国内务部（USD和美国地质调查局（USGS）发布了环境DNA采样技术规范。2019年日本环境DNA学会环境DNA采样、实验手册。2020年瑞士环境署颁布了联合苏黎世大学等单位发布了环境DNA水生生态生物监测和评价技术导则。2021年欧盟科技合作联盟（COST）出台了环境DNA生物评估方法指南。本标准与现行的法律、法规、标准没有任何冲突和重合。完全遵循国家水利、环保部门和相关部门的法
23、律法规，以及相关国家、行业标准的要求，与相关规范性文件一致、相互配套、相互衔接。本标准依据国内外相关标准，结合北京市水生态环境监测状况,河流、湖库状况,生物地理区系和历史监测数据的实际情况，规定了利用环境DNA技术监测大型底栖无脊椎动物的方法。本文件适用于北京市范围内河流、湖泊、水库等淡水水域类型中大型底栖无脊椎动物的监测。本标准主要参考鱼类贝类环境DNA识别技术规范（DB11/T20232022）还参考了淡水生物监测环境DNA宏条形码法（T/CSES812023）以及其他相关资料。5主要条款的说明5.1文件内容框架本标准的主要条款包括：第1章范围，规定了利用环境DNA技术监测大型底栖无脊椎动
24、物的方法。适用于北京市范围内河流、湖泊、水库等不同淡水水域类型中大型底栖无脊椎动物的监测。第2章规范性引用文件，本标准引用以下标准规范中对监测布点、DNA实验、测序等的要求GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T35537高通量基因测序结果评价要求HJ91.2地表水环境质量监测技术规范HJ494水质采样技术指导HJ1295水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价（试行）HJ1296水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价（试行）DB11/T1368实验室危险废物污染防治技术规范第3章术语和定义,给出了本标准中使用的大型底栖无脊椎动物、环境DNA、高通量测序、DNA条形码、聚合酶链
25、式反应（PCR）、索引（IndeX）、引物（Primer）、操作分类单元（OTU）、相对丰度、阳性对照样品等专业术语的解释和定义。第4章介绍了大型底栖无脊椎动物环境DNA监测原则及流程，监测原则包括：科学性原则、代表性原则、可操作性原则、可比性原则、保护性原则、安全性原则。监测流程分为准备阶段（监测目的的确定、监测方案制定、监测安排和准备），现场采样阶段（样品采集、样品运输和保存），样品处理阶段（样品前处理、环境DNA提取和纯化），实验室分析阶段（PCR扩增及测序、结果分析及记录）。第5章试剂和材料，规定了本标准中所使用试剂和材料的清单及具体要求。第6章仪器和设备，列出了环境DNA常用仪器设备
26、清单。第7章样品，规定了不同水体类型监测点位布设原则和方法、监测频次和时间、监测安排和准备、样品采集方式和保存方法。第8章分析步骤，规定了样品前处理和提取纯化方法，DNA浓度检测和保存要求。规定了PCR引物、扩增方法、PCR反应产物的凝胶电泳检测方法和产物质量要求，以及高通量测序要求第9章结果分析，规定了测序后得到的序列文件的质控、OTU聚类、物种注释要求。第10章质量保证与质量控制，规定了样品采集、保存、实验室分析等过程中的质控要求。规定了实验室内质控样品类型和精密度控制指标。第H章规定了注意事项。第12章规定了废弃物处理方法。5.2 主要技术指标、参数、实睑验证的论述本标准编制组充分调研国
27、内外标准和研究方法，收集整理北京市2020至2023年大型底栖无脊椎动物历史监测数据，并对2022年春夏秋三个季节60余个点位实际样品进行分析，分析标准方法的可行性，确定了应用环境DNA宏条形码技术监测北京市河流湖库的标准方法及技术路线，规范了质量保证质量控制方法，大型底栖无脊椎动物环境DNA监测规范技术路线图见图20样品采集分析方法THJ I 精密度方法应用研究力九 I_q(较阴性和假阳性率)(实际样品测试) 征求意见I (= I编写完善标准文本和编制说明文献调研确定方法核心 参数开展研究质保质控-lallsl分lfflg 凶-W:M 分Iffllgllall-lglllilgl一-lgll
28、gl介Igl一-llll布京一-ll!glsllglglall图2大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术路线5.2.1 采样点位设置参考地表水环境质量监测技术规范(HJ91.22022)、水质采样技术指导(HJ4942009)、水生态监测技术要求淡水大型底栖无脊椎动物(试行)的通知(总站水字(2021)629号)、水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价(试行)(HJ12952023)、水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价(试行)(HJ12962023)等标准规范，监测点位布设遵循连续性原则，一致性原则，代表性原则和可行性原则。充分考虑大型底栖无脊椎动物生活史、水体类型、深度、连通性、
29、水文和水化学等因素的影响。环境DNA在水体中的时空分布和浓度受多种因素影响。环境DNA采样和实验手册v2.2(Minamotoetal,2020)中规定应详细记录采样点位周边生镜和有无废水、生活污水排放等信息。生活污水中可能含有外源水生生物的DNA,导致环境DNA出现假阳性。因此，采样位点布设要充分考虑污水处理厂等人类活动影响因素。综上，按照HJ91.2,采样点位应覆盖监测区域代表性生境，综合考虑大型底栖无脊椎动物生活史和监测区域水体类型、生境、水文特征等因素的影响。根据研究目标和污染分布的空间异质性等因素可适当增加采样点位。河流点位布设原则和布设方法按照HJ1295。根据河流的宽度和深度设置
30、采样点位，河流宽度50m时，在两岸近岸水域布设2个采样点，河流宽度50m时在两岸近岸水域和中间共布设3个采样点，等比采集混合水样。湖泊、水库点位布设原则和布设方法按照HJ1296。根据区域内湖库形态、水文状况、水环境质量、水生生物分布等因素的差异，将湖库分为不同的小区域，如湖库滨岸带、沿岸带、湖库心区、主要河流出入口等，在每个小区域内布设监测点位。根据监测任务的目标，确定每个区域的监测点位数量。主要河流入口应设置采样点，库区每15km220km2应设置不少于1个采样点。将湖库群作为整体开展监测时，可适当调整监测点位数量。5.2.2 监测频次及时间监测频次及时间可根据监测目标而定。根据大型底栖无
31、脊椎动物的生命周期、生活史特征（如羽化期或繁殖期）、季节变化特征、监测目的等因素确定监测时间。按季节监测，可分别在春季、夏季、秋季、冬季各采样一次。5.2.3 样品采集由于环境DNA的分布和扩散受水体类型、水体大小、水流速、地形特征、河岸结构、人类活动排放等因素影响，样品采集时应详细记录采样点位、天气、采样时间、采样点位周边是否有污水排口、运输和保存条件等信息。按照HJ91.2,河流、湖库岸边采样：河流和湖库岸边点位用采水器在水面下0.5m范围内采集水样。水深不到0.5m时，在1/2水深处采样。河流、湖库分层采样：按照HJ91.2设置监测垂线上采样点位和数量。深度5m时，在水面下0.5m至距底
32、0.5m范围内设置1个采样点位。深度5mIOm时，在水面下0.5m和距底0.5m设置2个采样点位。深度10m时，在水面下0.5m、1/2水深处和距底0.5m设置3个采样点位。可根据监测目标，充分考虑大型底栖无脊椎动物特定类群的生活史调整分层点位和分层数量。河流湖库离岸点位：深度5m时，在水面下0.5m至距底0.5m范围内采集水样。水深不到0.5m时，在1/2水深处采样。深度5m10m时，在水面下0.5m和距底0.5m设置2个采样点位。深度1Om时，在水面下0.5m、1/2水深处和距底0.5m设置3个采样点位。水样采集按照HJ494的规定，每个采样点平行采集3次水样，每次采集1L。同时携带1L超
33、纯水作为采样阴性对照，用于检验采样过程中引入的污染情况。采水器采集的样品，装入采样瓶中。过滤体积为1L。2021年秋季，编制组选取北京市河流湖库代表性点位，涵盖了山区河流（水深小于Im）的河流、平原区河流（水深小于5m）、山区湖库（水深小于5m）。采集了表层水、表层沉积物和大型底栖无脊椎动物生物样品，系统地开展了采样介质、样品前处理研究，点位如表1所示。表1采样点位样品名点位责任区经度纬度水系山区平原河流湖库J17白河9密云区116.756540.62993潮白河水系山区河流J29庄户沟1怀柔区116.620640.74172潮白河水系山区河流J30汤河1怀柔区116.625340.96544
34、潮白河水系山区河流J31汤河3怀柔区116.661840.75674潮白河水系山区河流J65三家店门头沟区116.09539.95979永定河水系山区湖库J66门城湖丰台区116.100639.94751永定河水系平原区湖库J67晓月湖丰台区116.221239.86629永定河水系平原区湖库J68南大荒桥石景山区116.162639.88633永定河水系平原区河流J69戏水湾门头沟区116.060339.97942永定河水系山区河流目前环境DNA监测大型底栖无脊椎动物的采样介质主要是水样、沉积物、混合生物组织样品。水样和沉积物采样方法按照水质采样技术指导（HJ494）,混合生物组织采样方法按
35、照生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物（HJ71082014）同步采集形态学鉴定样品挑拣后获得混合生物组织样品。具体采样方法和前处理方式如下：采集水面下0.5m表层水样，返回实验室用0.45m和0.22m纤维素滤膜,过滤体积为ILo沉积物采集表层沉积物（05cm）,应剔除砾石、木屑、杂草、贝壳及其它大体积生物残体，收集至50ml无菌管中。经均质器均质后冷冻干燥，用网筛过滤杂质并混匀。混合生物组织样品采集：按照HJ710.8的规定进行定量采集与筛选大型底栖无脊椎动物，野外低温保存，实验室-20C保存。4解冻，沥干水分，加入35倍体积的无水乙醇（纯度299%）,1g换算为1mL,振荡混匀，
36、室温静置5天，吸取浸出液2ml,真空离心浓缩后提取DNA。水样采用离心柱法和磁珠法分别提取纯化基因组DNAo沉积物和混合生物组织采用磁珠法分别提取纯化基因组DNAo提取得到的DNA采用mCOIintF.jgHCO2198引物扩增。测序数据经过质控过滤后，筛选出大型底栖无脊椎动物类群并保留相对丰度占比大于千分之一的物种。形态学鉴定到软体动物门、节肢动物门、环节动物门21种底栖动物。混合生物组织DNA样品检出32种底栖动物，与形态学结果重合的有15种。混合生物组织的优势是便于和形态学结果比较，但是混合生物组织采样是损伤性的，前处理复杂难度大，同时也存在假阳性等问题。环境DNA定义是“从生物生活环境
37、中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含生物脱落、释放的细胞或游离的DNA-o混合生物组织的采样方式是从环境中分离目标生物，不符合环境DNA的定义。因此重点比较水样和沉积物。研究结果表明，水样和沉积物研究检测到的大型底栖无脊椎动物种水平重合度一般（图3）,水样检测到的大型底栖无脊椎动物物种数较多。0.45m滤膜富集的大型底栖无脊椎动物物种数较多。提取方式对物种组成影响较小，磁珠法提取得到的大型底栖无脊椎动物物种数较多。图3大型底栖无脊椎动物物种数比较Q：采样介质；b:水样滤膜孔径；c：DNA提取方法）2023年春季编制组选择官厅水库和密云水库，系统研究了采样深度和分层取样对结果的影响。官厅水库
38、属于河流型水库，深度约为515m.按照HJ1296的规定，遵循与历史点位的一致性原则，设置2个近岸点位码头（G5）和月亮岛（G6）,4个离岸点位分别为妫1080（Gl）、妫大桥（G2）、河口（G3）、坝前（G4）（图4）。妫1080、妫大桥、坝前三个点位深度在IOm以上，河口点位深度5m左右。图4官厅水库采样点位按照HJ91.2,设置分层点位和分层数量。分表、中、底层采集样品（在水面下0.5m、1/2水深处和距底0.5m设置3个采样点位）混合样品为表、中、底层样品等体积混合。妫1080（Gl）妫大桥（G2）、坝前（G4）点位表、中、底、混合样品编号分别为点位名称、_2、_3、_4。河口点位深度
39、5m左右，采集表层和底层样品（表层：水面下0.5m,底层：距底0.5m）以及表层和底层等体积混合样品。样品编号分别为点位名称、_2、_3。岸边点位在水面下0.5m采集表层水。每个样品过滤IL水样。在4个离岸点位妫1080（Gl）妫大桥（G2）、河口（G3）、坝前（G4）用彼得逊采泥器采集底泥50g左右，样品编号为点位名称_T。mCOIintF、jgHCO2198引物扩增。测序数据经过质控过滤后，筛选出大型底栖无脊椎动物类群并保留相对丰度占比大于千分之一的物种。岸边点位和分层样品物种分布如图5o进一步采用组间ANOSIM检验分析分层分组间物种组成差异，如图6所示。分层样品表、中、底层样品与混合样
40、品之间均无显著差异。分组RP值表层/中层-0.0260.559表层/底层-0.0370.516表层/混合-0.0680.633中层/底层0.2960.076中层/混合-0.0160.445底层/混合0.2960.173class.vec图6组间ANOSIM检验密云水库是华北地区第一大水库。该水库坐落在潮、白河中游偏下，系拦蓄白河、潮河之水而成,库区跨越两河。水库最高水位水面面积达到188平方公里，水面137000亩，分白河，潮河、内湖三个库区，最大库容量为43.75亿立方米，水深40米至60米。按照HJ1296的规定，遵循与历史点位的一致性原则，设置4个离岸采样点位，分别为潮河主坝（CH）.白
41、河主坝（BH）、库东（KD）、库西（KX）,2个岸边点位分别为九场取水口（JC）和内湖岸边（NH）（图7）。图7密云水库采样点位按照HJ9L2,设置分层点位和分层数量。河主坝（CH）、白河主坝（BH）、库东（KD）.库西（KX）4个离岸点位分表、中、底层采集样品（在水面下0.5m、1/2水深处和距底0.5m设置3个采样点位），混合样品为表、中、底层样品等体积混合。表、中、底、混合样品编号分别为点位名称、一2、_3、_4。岸边点位在水面下0.5m采集表层水。每个样品过滤IL水样。潮河主坝（CH）、白河主坝（BH）、库东（KD）、库西（KX）4个离岸点位用彼得逊采泥器采集底泥50g左右，样品编号分
42、别为点位名称_T。mCOIintF、jgHCO2198引物扩增。测序数据经过质控过滤后，筛选出大型底栖无脊椎动物类群并保留相对丰度占比大于千分之一的物种。岸边点位样品和分层样品物种分布如图8。采用组间ANOSlM检验分析分层分组间物种组成差异，如图9所示。表、中、底层样品与混合样品之间均无显著差异。Rffvenfage图8大型底柄无脊椎动物物种分布分组RP值表层/中层-0.0190.513表层/底层-0.1130.755表层/混合-0.0830.747中层/底层-0.0360.503中层/混合-0.1200.743底层/混合0.0030.397图9组间ANOSIM检验综上所属，兼顾采样便捷性、
43、代表性和北京市城市河道多数为人工底质等因素,推荐采集水样。采集样品时应先采集环境DNA样品。近岸点位：河流点位和湖库岸边点位用采水器在水面下0.5m范围内采集水样。水深不到0.5m时，在1/2水深处采样。河流、湖库离岸点位按照HJ91.2,设置分层点位和分层数量。深度S5m时，在水面下0.5m至距底0.5m范围内采集水样。水深不到0.5m时，在1/2水深处采样。深度5m10m时，在水面下0.5m和距底0.5m设置2个采样点位。深度AlOm时，在水面下0.5m、1/2水深处和距底0.5m设置3个采样点位。建议根据研究目标设置分层数量，采集分层水样或分层混合水样。条件具备时，在同一点位也可补充采集
44、沉积物样品，沉积物样品采样和前处理方式见附录C,沉积物监测结果可与水样合并使用O5.2.4 环境DNA富集选择大型底栖无脊椎动物种类较丰富的北京市房山拒马河水生野生动物自然保护区内五渡点位采集原位沉积物并挑拣出大型底栖无脊椎动物，形态学分类鉴定到扁蜉科(优势种)、直突摇蚊属、摇蚊属、梨形环棱螺、蛆科、蛭纲、蜻科。返回实验室将原位沉积物和大型底栖无脊椎动物放入水箱中，加入无菌水饲养15天后开展模拟实验。采用10种不同材质和孔径的滤膜富集环境DNA,如表2所示。探讨过滤体积和滤膜材质、孔径对实验结果的影响。表2漉膜孔径和材质序号材质孔径(m)备注SD_1混合纤维素酯(MCE)0.45国产SD_2混
45、合纤维素酯(MCE)0.8国产SD_3聚四氟乙烯(PTFE)0.45国产SD_4聚偏二氟乙烯膜(PVDF)0.45国产SD_5聚丙稀(PP)0.45国产SD_6尼龙(NY66)0.45国产SD_7聚酸飒(PES)0.45国产SD_8聚醛飒(PES)0.45进口SD_9聚酸飒(PES)0.2进口SD_10玻璃纤维(GF)0.6进口水样分别过滤0.5L和IL,mCOIintFjgHCO2198引物扩增。测序数据经过质控过滤后，筛选出大型底栖无脊椎动物类群并保留相对丰度占比大于千分之一的物种。共鉴定到大型底栖无脊椎动物22属，隶属于软体动物门的腹足纲和瓣鲤纲，环节动物门的寡毛纲，节肢动物门的昆虫纲、
46、蛛形纲、甲壳纲，如表3所Zjx0表3物种名录门纲R科属genus软体动物门腹足纲基眼目椎实螺科萝卜螺属Radix软体动物门瓣鳏纲真瓣鲤目蜘科蜘属Corbicula软体动物门腹足纲基眼目膀胱螺科膀胱螺属Physa软体动物门腹足纲中腹足目斛螺科狭口螺属Stenothyra环节动物门寡毛纲颤蚓目颤蚓科水丝蚓属Limnodrilus环节动物门寡毛纲颤蚓目仙女虫科仙女虫属Nais环节动物门寡毛纲颤蚓目仙女虫科尾盘虫属Dero环节动物门寡毛纲颤蚓目颤蚓科颤蚓属Tubifex环节动物门寡毛纲颤蚓目仙女虫科头鳏蚓属Branchiodrilus环节动物门寡毛纲颤蚓目颤蚓科尾鲤蚓属Branchiura环节动物门寡毛纲颤蚓目颤蚓科河蚓属Rhyacodrilus节肢动物门昆虫纲蜻蜓目蜻科赤蜻属Sympetrum节肢动物门昆虫纲蜉蟠目四节蜉科原二翅摇蚊Procloeon节肢动物门昆虫纲靖蜓目春蜓科叶春蜓Ictinogomphus
