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1、第6章 Pre-RNA processing,6.1 原核生物rRNA和tRNA转录后加工,6.1.1 rRNA转录后加工6.1.1 tRNA转录后加工,原核细胞rRNA前体的加工,6.1.1 rRNA转录后加工,rRNA的加工,tRNA的加工分成3个阶段“斩头”：形成5末端RNase P具有内切酶的活性，可切除前体tRNA 5端的前导序列（41nt）去尾：切除多余的核苷酸形成3-OH末端。缺-CCA的 tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TC臂的假尿苷（）和反密码子环上的
2、2异戊腺苷（2ipA),6.1.2.tRNA的加工,6.2 Pre-RNA processing in Euk.,6.2.1 概念,pre-RNA,capping tailingsplicing methylationediting,生物学意义;,mature RNA,prevent pre-RNA from digested by RNase,6.2.2 pre-RNA capping,Cap-0 m7GpppXpYp-(共有)Cap-1 m7GpppXmpYp-Cap-2 m7GpppXmpYmp-,1、帽子的种类,HNCH3,m7G,帽子0,其中:,单细胞真核生物只有 Cap0,Cap1
3、 是其余真核生物的主要帽子形式,Cap2 存在于某些真核生物中,2、帽子结构的生成,甲基供体都为S腺苷甲硫氨酸（SAM）,RNA鸟苷酸转移酶-戴帽酶（capping enzyme）,3、帽子结构的功能,（1）对翻译起识别作用-为核糖体识别RNA提供信号 Cap0 的全部都是识别的重要信号 Cap1,2 的甲基化能增进识别,（2）增加mRNA 的稳定性，使5端免遭外切核酸酶的攻击,（3）与某些RNA病毒的正链合成有关（Cap1、Cap2）,除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化m6A形式,6.2.3 pre-RNA tailing,1、3端-约长200bp(大多数Euk.的mRNA)（poly
4、(A)+poly(A)-）,最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有3添加 poly(A)的现象,E.coli 的poly(A)+聚合酶早在1962年就已发现,2、poly(A)的生成,a、RNA末端腺苷酸转移酶（poly(A)聚合酶）催化 前体ATP,反应如下：多聚核糖核酸+nATP,Mg+或 Mn+,多聚核糖核酸(A)n+nPPi b、添加位点 内切酶(360KDa)切除一段序列,由poly(A)聚合酶 催化添加poly(A),内切酶的识别位点（有其它因子参与）,切点上游 1320bp处的 AAUAAA 切点下游的 GUGUGUG（单细胞Euk.除外）,特异 内切酶识别AAUAAA及随后的
5、GUGUGUG并在其间酶切，在3端聚合50-200poly(A),3、poly(A)的功能,c、对含 poly(A)的mRNA 失去 poly(A)可减弱其翻译,（1）可能与核质转运有关,（2）与mRNA的寿命有关,（3）与翻译有关,a、缺失可抑制体外翻译的起始,b、胚胎发育中，poly(A)对其mRNA的翻译有影 响（非poly(A)化的为储藏形式）,（4）poly(A)在分子生物学实验中有很大应用价值,a、也可将 oligo(dT)与载体相连，从总体RNA中分离 纯化mRNA,b、用寡聚dT（oligo(dT)）为引物，反转录合成 cDNA,6.2.4.RNA Splicing,Prima
6、ry transcript,The consensus sequences for human,5splice site(5剪接位点):the exon-intron boundary at the 5 end of the intron3 splice site(3剪接位点):the exon-intron boundary at the 3 end of the intronBranch point site(分枝位点):an A close to the 3 end of the intron,which is followed by a polypyrimidine tract(Py
7、tract).,RNA splicing models,group I of intron(chloroplast&mitochondrial)真核 生物细胞器基因，低等真核生物核rRNA基因,Group II of intron:只见于某些真菌线粒体和植物叶绿体基因,hnRNA 的拼接：需要剪接体,由核糖核蛋白介导,tRNA基因的内含子均位于 tRNA 的反密码环上,四种内含子的边界序列各有一定共同的特征,拼接方式,方式一：由拼接装置完成（核mRNA内含子）可供识别的特异序列 拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成,方式二：自我拼接（两类内含子、）形成特定的二级结构 RNA具有催化拼接的能力,方式
8、三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应,b)I类内含子拼接特点(四膜虫 35s rRNA model),5-exon-UpA-intron-GpU-exon-3,高度保守，转酯反应的攻击位点,2、拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）P295（1）两种rRNA转录在一条35S的产物中，26SrRNA 有内元,5 U G 3 小rRNA 大rRNA（26S 有内含子）,（2）35SRNA体外有自我拼接的能力 反应需要：一价和二价离子 鸟苷酸辅助因子（GTP GDP GMP和 鸟嘌呤核苷）不需能量的供给,（3）拼接反应后，G与内含子（414base）5端以磷酸二
9、酯键相连,（4）具体的拼接过程 第一步：游离G发动的转酯反应 G 的 3-OH 攻击内元的 5拼接点,第二步：游离外显子（左）发动的转酯反应 左外显子的3-OH 攻击3拼接点，同时释放 线状的内含子,形成成熟RNA分子,两次转酯反应是紧密偶联的 释放出的内含子可继续进行转酯反应 而形成环状,型内含子的自我剪接四膜虫35S rRNA前体的剪接反应是型的典型代表。特点是需要鸟苷参与。,科罗拉多大学Cech等人完成（美）,活性位点,（4）总结：四膜虫的 35SRNA 的内含子有自身催化的性质 即-将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷 酸二酯键，不需要额外的能量,因此：内含子可以看作是 RNA重排
10、酶（RNA rearrangease）或 RNA异构酶（RNA isomerase）,其中：拼接反应中，“酶”和底物是同一个分子，且反应后 变成了不同的分子,主要特征：,专一性强,加快反应速度,反应前后酶分子保持不变,人们称这种由RNA构成的酶为-,核糖核酸酯酶（ribozyme）可简称 R酶,c)II 类内含子拼接特点(Michel 1982),拼接点序列,7核苷酸的保守序列（Branch Site）3 拼接点上游 6bp 12bp 处,型内含子的自我剪接不需要鸟苷参与，而由其自身结构决定。特点是形成套索内含子。,E complex,A complex,B complex,C complex
11、,（d）splicesome介导的拼接反应,1、相关概念 Euk.的细胞中，有许多碱基数在100 300之间 的小分子RNA,每个细胞有 105106个,snRNA：细胞核中的（snRNP）scRNA：细胞质中的（scRNP）lariaf structure（套索结构）,2、核mRNA内含子拼接的结构特点,拼接点序列,Breathnach-Chambon rule（GUAG规则）,Assembly,rearrangement,and catalysis within the spliceosome,Assembly step 11.U1 recognize 5 splice site.2.On
12、e subunit of U2AF binds to Py tract and the other to the 3 splice site.The former subunits interacts with BBP(branch point binding protein)and helps it bind to the branch point.3.Early(E)complex is formed,Splicing pathways,E complex,Assembly step 21.U2 binds to the branch site,and then A complex is
13、formed.2.The base-pairing between the U2 and the branch site is such that the branch site A is extruded(挤出).This A residue is available to react with the 5 splice site.,A complex,Assembly step 31.U4,U5 and U6 form the tri-snRNP Particle.2.With the entry of the tri-snRNP,the A complex is converted in
14、to the B complex.,B complex,A complex,Assembly step 4U1 leaves the complex,and U6 replaces it at the 5 splice site.U4 is released from the complex,allowing U6 to interact with U2.This arrangement called the C complex.,B complex,C complex in which the catalysis has not occurred yet,C complex,1st reac
15、tion,2nd reaction,第一次转酯左外显子、内含子剪切套索,lariat,第二次转酯exons连接、套索状内含子释放,剪接体（spliceosome）解体与lariat降解同步,G instead of A,a linear intron,a Lariat intron,P300,e)选择性剪接（alternative splicing）,Many genes in higher eukaryotes encode RNAs that can be spliced in alternative ways to generate two or more different mRNAs
16、 and,thus different protein products.,Single genes can produce multiple products by alternative splicing,Drosophila DSCAM gene can be spliced in 38,000 alternative ways,There are five different ways to alternatively splice a pre-mRNA,Alternative splicing can be either constitutive or regulated,Const
17、itutive alternative splicing:more than one product is always made from a pre-mRNARegulative alternative splicing:different forms of mRNA are produced at different time,under different conditions,or in different cell or tissue types,An example of constitutive alternative splicing:Splicing of the SV40
18、 T antigen RNA,Alternative splicing is regulated by activators and repressors,The regulating sequences:exonic(or intronic)splicing enhancers(ESE or ISE)or silencers(ESS and ISS).The former enhance and the latter repress splicing.Proteins that regulate splicing bind to these specific sites for their
19、action,Alternative splicing,Regulated alternative splicing,Drosophila sex expression Sxl(性致死基因),组成型剪接,选择性剪接,6.2.5 rRNA 的剪接与成熟,SnoRNA参与核酶对特定立体结构的识别；rRNA前体分子的甲基化。P277,20s,32s,6.2.6 tRNA前体的加工：原核与真核生物的tRNA转录后都需要加工。包括：（1）由核酸内切酶切除前体上3和5端上多余核苷酸；（2）由核酸外切酶逐个在3切去附加序列，进行修剪。（3）3端添加CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。（4）核苷的一些特定的碱
20、基和戊糖进行修饰。,6.2.7 RNA editing(编辑),概念：在mRNA水平上改变信息的过程，通过在转录后或转录中的RNA顺序中增加、缺失或者核苷酸的替换，改变DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。编辑方式I.Site specific deaminationII.gRNA-directed U insertion or deletion,I.Site specific deamination（脱氨基化）:1.A specifically targeted C residue within mRNA is converted into U by the dea
21、minase.2.The process occurs only in certain tissues or cell types and in a regulated manner.,RNA editing,The human apolipoprotein gene载脂蛋白基因,Stop code,In liver,In intestines（肠）,3.Adenosine deamination（腺苷脱氨基化）also occurs in cells.The enzyme ADAR(adenosine deaminase acting on RNA)convert A into Inosin
22、e.Inosine can base-pair with C,and this change can alter the sequence of the protein.4.An ion channel expressed in mammalian brains is the target of Adenosine deamination.,II Guide RNA-directed uridine insertion or deletion.1.This form of RNA editing is found in the mitochondria of trypanosomes（椎体虫）
23、.2.Multiple Us are inserted into specific region of mRNAs after transcription(or US may be deleted).,3.The addition of Us to the message changes codons and reading frames,completely altering the“meaning”of the message.4.Us are inserted into the message by guide RNAs(gRNAs).,Having three regions:anch
24、or directing the gRNAs to the region of mRNAs it will edit.editing region determining where the Us will be inserted poly-U stretch（伸展）,gRNAs,editing mechanism,主要在线粒体和病毒中发现,editing 内容主要涉及RNA 中,-U deletion&insertion，由gRNA指导,-C U,A I transition,Guide RNA(gRNA):与被编辑的mRNA的前编辑区及周围部分核酸序列有相当程度的互补，为插入U提供模板,Editing 的生物学意义,形成/删除AUG,UAA,UAG,UGA,改变codon信息,扩大编码的遗传信息量,mRNA editing 较大程度地改变了DNA的遗传信息，使该基因的DNA序列仅是一串简略意义模糊的序 列或称为隐秘基因(cryptic gene)、模糊基因（cryptogene）,中心法则的发展,真核生物和原核生物转录的差别,DNA,核,核糖体,新生蛋白质,真核生物,原核生物,mRNA前体,转运,加工,mRNA,mRNA,区域不同 RNA聚合酶不相同 启动子不同 转录后RNA加工修饰不同,
