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1、1,基因治疗的原理 与研究进展,2,基因治疗分类,体细胞(somatic cell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗,只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代,3,一、基因治疗的概念,狭义的概念指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的广义的概念指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。,4,二、基因治疗的总体策略,(一)基因矫正纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。(二)基因置换指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。(三
2、)基因增补把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去,5,(四)基因失活将特定的反义核酸(反义RNA、反义DNA)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。(五)“自杀基因”的应用在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”(六)免疫基因治疗免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等。(七)耐药基因治疗耐
3、药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1,6,三、基因治疗的基本程序,(一)治疗性基因的获得(二)基因载体的选择(三)靶细胞的选择(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内,7,四、基因治疗的现状与展望,基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。基因治疗与常规治疗方法不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因
4、治疗针对的是疾病的根源-异常的基因本身。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。基因,8,治疗研究一般要符合下列要求,为已明确了的单基因缺陷疾病；仅限于体细胞；靶细胞的亲缘性和可操作性等；有明显疗效和无或低危害性等；表达水平稳定时程长；必须有动物实验基础。,9,参考资料（2008.2）,1.基因诊断和基因治疗在我国临床应用的情况如何？基因诊断方面在我国，目前基因诊断在以下几个方面已进入临床实用阶段。（1）遗传病的产前诊断。通过基因诊断，可检测胎儿性别，这对与性染色体有关的遗传病的诊断是十分必要的。对于高发性的遗传病，如地中海贫血、
5、镰刀状贫血、凝血因子缺乏等基因诊断已在临床应用多年，为优生优育作出了贡献。（2）致病病原体的检测。当致病病原体进入人体后，可引起相应的疾病。当我们了解其核酸序列后，就可以设计引物和探针，通过基因检测进行诊断。目前已应用于病毒（乙肝）、细菌（结核）、原虫（梅毒螺旋体）等病原体的检测。,10,（3）癌基因的检测和诊断。通过研究，人们已阐明部分癌症基因与癌症之间的关系。目前，在临 床上可以用基因检测方法诊断白血病、肺癌、神经胶质瘤等疾病。除此以外，基因诊断技术还广泛应用于DNA指纹分析、个体识别、亲子鉴别等司法鉴定，以及动 植物检疫与转基因动植物中阳性基因的检测等方面。基因治疗方面我国是世界上较早开
6、展基因治疗研究的国家之一。1991年，我国科学家进行了世 界上首例B型血友病患者的基因治疗临床试验。目前已有4名血友病患者接受了基因治疗，治疗后体内IX因子浓度上升，出血症状减轻，取得了安全有效的治疗效 果。此后，我国科学家利用胸腺激酶基因，对恶性脑胶质瘤进行基因治疗的方案，已获准进入I期临床试验。初步的观察表明，生存期超过1年者占55%，其中1 例已超过三年半，至今仍未见肿瘤复发。此外，采用血管内皮生长因子基因，对外周梗塞性下肢血管病进行基因治疗的方案，也已获准进入临床试验。目前，我国已 有6个基因治疗方案进入或即将进入临床试验。我国的基因治疗研究在建立高效、靶向性基因导入系统等关键技术方面
7、取得重大进展，如靶向性非病毒载体和腺病毒伴随病毒载体系统的建立，具有国际前沿水平和自主的知识产权。,11,2.如何实施产前诊断？产前诊断对胚胎有没有不良影响？产前诊断方法可分为三类五个水平。第一类是采用特殊仪器检查胎儿体表是否有畸形，例如，用X线照片、体表造影或B超等进行间接观察；或在胎儿镜下进行直接观察。此类检查属形态学水平。第二类是采用母体血、尿等特殊检查，间接诊断胎儿先天性疾病。在母体孕期，少量胎儿血细胞、可扩散的代谢产物，以及蛋白质和酶等物质，可通过胎盘进入母体血液循环系统，这是母亲的血、尿可作某些疾病产前诊断的基础。例如，测定孕妇血甲胎蛋白（AFP），可诊断胎儿神经管畸形（NTD），
8、测定孕妇尿甲基丙二酸，可诊断胎儿甲基丙二酸尿症。第三类是直接获取胎血、羊水或胎儿组织来诊断胎儿疾病。三类检查方法，可以从形态学、染色体、酶学、代谢产物和基因等五个水平，进行产前诊断。产前检查基本没有不良影响。,12,3.什么是基因治疗的体内治疗？什么是基因治疗的体外治疗？什么是体细胞的基因治疗？什么是生殖细胞的基因治疗？基因治疗的体内治疗：即直接将基因导入体内的治疗方法。可分为：（1）异位导入，将基因导入非病变的细胞，如皮下，肌肉等；（2）原位导入，将基因导入直接病变的部位，如肿瘤细胞、骨髓细胞等。基因治疗的体外治疗（回输）：即将病人的部分组织或细胞取出，在体外培养导入基因后，再回输入体内。体
9、细胞基因治疗：是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体的特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。生殖细胞的基因治疗：是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞）或中早期胚胎，使 其可以发育成正常个体。显然，这是理想的治疗方法。实际上，这种靶细胞的遗传修饰，至今尚无实质性进展。基因的这种转移一般只能用显微注射法，然而这种方 法效率不高，并且只适用排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。而在人类中将基因转移到生殖细胞，并使其世代遗传，又会涉及
10、到伦理学问题。因此，就人 类而言，目前多不考虑生殖细胞的基因治疗途径。,13,一、基因治疗的策略,内容提要,二、基因转移技术,四、治疗基因的受控表达,三、基因干预,五、基因治疗的应用研究,14,一、基因治疗的策略,The Strategy of Gene Therapy,15,（一）基因置换（gene replacement）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。,目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。,16,又称为基因打靶(gene targeting）定点整合的条件:转
11、导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。,基因同源重组技术,17,要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。,定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。,18,（二）基因添加,基因添加或称基因增补（gene augmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。,类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因
12、的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。,19,（三）基因干预基因干预（gene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。,20,（四）自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。,21,自杀基因的作用机制,22,TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus,HSV）型胸苷激酶（thym
13、idine kinase,tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。,CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。,1.自杀基因系统,23,旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。,2.旁观者效应,24,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入
14、肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,25,二、基因转移技术,The Technique of Gene Transfer,26,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,27,基因转移(gene transfer)技术：,1.病毒介导的基因转移系统。2.非病毒介导的基因转移系统。,28,1.病毒介导的基因转移系统,病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。,29,Retrovirus,（1）逆转录病毒,30,31,（1）两端各有一长末端
15、重复序列LTR。,逆转录病毒前病毒的结构特点,（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。,（3）病毒有三个结构基因,（4）5端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。,（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。,(1)在U3内有增强子和启动子；(2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)；(3)在R内还有poly(A)加尾信号。,(1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；(2)pol基因，编码逆转录酶；(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,32,33,逆转录病毒
16、介导的基因转移系统由两部分组成：,(1)逆转录病毒载体,(2)辅助细胞株(如PA317),34,Retroviral packaging system,35,逆转录病毒载体的特点,逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。,逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。,包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。,36,逆转录病毒载体的主要缺点,
17、随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。,37,（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,38,39,腺病毒的优点,1.基因导入效率高，对人类安全；,2.宿主范围广；,3.基因转导与细胞分裂无关；,4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾
18、吸入或气管内滴注；,5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；,40,腺病毒载体缺点,2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。,3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。,(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。,41,（3）腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状D
19、NA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。,42,Structure of AAV Virus Genomic DNA,REP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因,43,AAV的特点,以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。,44,AAV载体是目前正
20、在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。,45,AAV载体的缺陷：,46,2.非病毒载体介导的基因转移系统（1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移
21、至细胞内，并进行表达。,47,脂质体介导的基因转移示意图,48,（2）受体介导转移技术,将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,49,受体介导转移技术示意图,50,（3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维
22、持数月之久。1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%40%；2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；3.肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。,51,基因直接注射法的优点,1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。,52,三、基因干预,Gene Interference,5
23、3,基因干预的种类：,1.反义RNA(antisense RNA)2.干扰RNA(RNA interference)3.核酶(ribozyme),54,（一）反义RNA 1.反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。,55,反义RNA的关键技术问题：,反义RNA进入靶细胞前的降解问题,专一性转移问题：,56,2.受体介导反义RNA技转移术,受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；被转移
24、的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。,将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。,借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。,57,3.反义RNA的应用前景,受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。,（l）安全性高,（2）反义RNA设计和制备方
25、便,（3）具有剂量调节效应,（4）能直接作用于一些RNA病毒,反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”。,在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基因治疗比一般的DNA基因治疗有更大的优势。利用反义RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。,58,（二）干扰RNA,实验结果显示，有义链RNA（sense RNA）或反义链RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。将特异的双链RNA注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链
26、RNA和反义链RNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。,1.RNA干扰现象,RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。,对RNA干扰的认识来源于用线虫（C.elegans）和果蝇所进行的实验。,59,2.RNA干扰的机制,RNA干扰过程主要有2个步骤：,（1）小干扰性RNA（siRNA）,（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RN
27、A-induced silencing complex,RISC)。,该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。,长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）。,60,A.贾第鞭毛虫Dicer的晶体结构；RNA干扰机制示意图,61,1.体外化学合成;,2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。,siRNA的产生,62,3.RNA干扰的应用前景 RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得
28、了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。,63,（1）研究基因功能的新工具,由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。,RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。,64,（2）肿瘤的基因治疗,传统反义RNA技术诱发的单一癌基因的阻断，不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNA干扰技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的双链RNA分子，只使用
29、一种双链RNA即可以产生多个基因同时剔除的表型，也可以同时使用多种双链RNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。RNA干扰技术可用于治疗有异常基因表达的恶性肿瘤。,K-RAS蛋白为肿瘤发生所必需，bcr/ab1融合基因与人白血病有关，用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。应用RNA干扰技术成功地阻断了MCF-7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。,65,（3）病毒性疾病的基因治疗 RNA干扰可以被看成
30、是一种与免疫系统类似的防御机制。用siRNA抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表达，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻碍HIV在细胞内复制。用RNA干扰技术抑制HIV的受体（CD4）或辅助受体（CXCR4或CCR5）在细胞内表达，可阻碍HIV感染细胞。也可通过RNA干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。,66,siRNA在病毒感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，RNA干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意义。,67
31、,（三）核酶(ribozyme),天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。,在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。,68,1.核酶的设计,核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。,（1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶
32、切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。,（2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。,在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。,69,核酶的作用机制,70,2.核酶的应用,与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。,71,四、治疗基因的受控表达,Regulated Expression of Therape
33、utic Gene,72,时间:,要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。,治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。,空间:,表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。,1.控制治疗的基因在患者需要实施治疗时才表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；2.根据不同疾病的治疗要求，控制治疗基因持续表达的时间跨度。,是指为了提高基因治疗的专一性和安全性，严格限制治疗基因只在靶细胞中表达，避免治疗基因指导合成的蛋白质干扰非靶细胞
34、的正常生活，产生毒副作用。,73,（一）基因内部的调节机制使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件,74,1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件,例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。,不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因的特异性表达，从而起到治疗作用。,前列腺特异性抗原(PSA)是参与精液凝块中蛋白质降解、使精液液化的一种丝氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中产生，而在前列腺癌细胞中含量很高，
35、可以利用PSA基因调控元件驱动治疗基因在PSA阳性的前列腺癌细胞中表达而发挥作用，而其在PSA阴性细胞和非前列腺癌细胞中不能使治疗基因表达。,75,2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件,某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。,甲胎蛋白(AFP)基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFP基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺癌细胞中表达很高，采用其启动子可以使治疗基因只在CEA阳
36、性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。,76,（二）基因外部的调节机制,除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。,采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性表达的目的。,Egr-1基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱导其表达，将其调控序列启动的治疗基因(如肿瘤坏死因子基因)导入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时性的局部表达，杀死肿瘤细胞。,组织纤溶酶原激活物(t-PA)作为溶解血栓的药剂，在中风和心肌梗死等疾病治疗中起着
37、重要的作用。t-PA的活性在辐射后增加50倍，表明其基因表达调控元件中存在受辐射诱导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，增强放疗效果。,77,（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达,病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。,例如，在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白GRP78/Bip的含量也随之增加，使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死。,肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。缺氧条件可以通过缺氧诱导因
38、子(HIF-1)和缺氧响应元件(HRE)相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件(HRE)来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。,机体发炎时所可产生的许多急性期蛋白，其基因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达；而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。,78,（四）治疗基因的诱导表达 采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些可诱导性基因表达系统。这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它只在诱导药物存在时才能与DNA结合；另一种则是特异性基
39、因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。,79,四环素抗性操纵子系统原理,四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达；四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。,80,81,五、基因治疗的应用研究,The Application of Gene Therapy,82,世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症。1990年9月美国Blaese博士成功地将正常的人的ADA基因植入ADA缺乏症病人的淋巴结内，完
40、成世界上首例基因治疗试验。,83,（一）遗传病的基因治疗研究,已知人类有4000多种遗传病，在人群中的发病率约为4050。但真正了解病因，能进行产前诊断的仅限于那些为数不多的常见遗传病。,1.在DNA水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因的表达不需要精确调控；4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞(如皮肤细胞，骨髓细胞等)中表达并发挥其生理作用；5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求的不过只有30余种遗传病。,遗传病基因治疗必须符合以下要求：,84,1腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症
41、2珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征 6家族性高胆固醇血症 7囊性纤维化病,85,（二）恶性肿瘤基因治疗研究,（1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；,肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。,（2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；,（3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；,（4）通过导入“自杀基因”杀伤癌细胞。,86,1.肿瘤基因治疗的
42、基本策略 从实际应用于临床治疗的角度来看，肿瘤基因治疗的策略包括：(1)直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。(2)增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤细胞。(3)改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。,87,2.肿瘤基因治疗的常用方法 基因干预技术：通过基因干预，使得肿瘤细胞过度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。自杀基因治疗分子化疗：直接杀死肿瘤细胞。肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。,88,3.自杀基因治疗：自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。,基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存
43、在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因的肿瘤细胞“自杀”。这些基因也相应地被称为“自杀基因”。,89,自杀基因治疗的前提条件是“自杀基因”的表达必须局限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。,利用免疫脂质体、受体介导等技术进行定向基因转移。利用病毒载体进行基因转移。肿瘤特异性基因转录。肿瘤内直接注射。,自杀基因转移常用方法,90,4.肿瘤的免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括细胞因子（或受体）基因治疗和抗原抗体基因治疗两大类。,9
44、1,5.提高化疗效果的辅助基因治疗：,临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：,（1）是患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。,（2）是大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。,92,(1)药物增敏基因治疗：,将鸡钙调素（calmodulin,CaM）基因导入小鼠乳腺癌细胞株C127，结果仅需低剂量的长春新碱或长春花碱即可明显抑制该细胞株的生长。对其作用原理进行研究后发现，CaM基因的表达产物作为细胞内信号传导系统的重要物质，明显增加
45、了肿瘤细胞对长春新碱或长春花碱的吸收量而相应减少了排出量，从而提高了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤细胞死亡。,为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以考虑将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。,93,(2)耐药基因治疗：,在解决化疗所致骨髓细胞造血功能受到严重抑制的问题方面，通过向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，如mdr-1基因等，以增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。,肿瘤细胞耐药性的产生与多种糖蛋白或酶有关，包括多药耐药（mdr-1）基因编码的
46、P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白（MRP）以及近年来发现的肺耐药相关蛋白等；还有细胞内氧化和解毒作用的酶系统，包括细胞色素P-450（cytochrome P-450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等等。,目前除了开发针对肿瘤细胞耐药性产生机制的拮抗剂，如用于阻断P-糖蛋白所引发多药耐药的戊脉安（verapamil）和用于阻断GSH合成的丁硫氨酸亚砜胺（BSO）等。还采用基因干扰技术，在基因水平阻断耐药基因的表达，使肿瘤细胞丧失多药耐药性，从而易于被化疗药物杀死。,94,（三）病毒性疾病的基因治疗研究,据统计，75%的人类传染病是由病毒引起的。病毒感染人体后不
47、仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。研究表明，它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病也存在一定的联系。迄今为止，临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，而在众多开展的抗病毒治疗方案中，抗病毒基因治疗十分引人注目。,95,1调节机体免疫应答：,（1）将细胞因子(如干扰素、白细胞介素等)的基因，导入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和体液免疫应答，促进机体清除病毒感染细胞和游离病毒。（2）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，表达的抗原不仅可以诱导机体产生
48、保护性抗体，还可以引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生致病病毒攻击的防御作用。,96,2抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的，主要包括：,（1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。,（2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。,（3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。,（4）RNA干扰技术。,（5）将抗病毒蛋白质基因，如25腺苷酸合成酶等基 因，导入机体细胞并持续表达，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA，对RNA病毒的感染产生明显的抵抗作用。,97,（四）其他疾病的基因治疗研究,神经退化性疾病（如帕金森氏病）:由于腺病毒可以感染有丝分裂后
49、的细胞，同时具有潜在的高转导效率和在中枢神经系统免疫特惠区（immunologically privileged site）中的低病原性，因此是进行神经系统疾病基因治疗的有效载体。,神经母细胞（neuroprogenitor）和人星型胶质细胞可以作为自体同源细胞用于ex vivo修饰。使用四环素调节的腺病毒载体来表达酪氨酸羟化酶在动物模型中用ex vivo技术表现出了可观的前景。在用脑衍生神经营养因子（BDNF）腺病毒重组体缓解亨廷顿疾病的实验过程中，发现表达BDNF的大鼠取得了明显结果。,（1)重组载体的脑内直接注射；(2）采用取出体内细胞在体外经由载体转染修饰后回输脑内相关区域。,两种传递治疗基因的主要策略：,98,基因治疗的问题与展望,治疗基因调控元件的选择；安全高效载体的构建和转移技术的 选择；靶细胞的选择。,
