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1、细胞凋亡(Cell apoptosis),一、概述二、细胞凋亡的信号通路三、重要的凋亡控制基因四、细胞凋亡的检测,主 要 内 容,目的与要求,了解细胞凋亡的概念及调控机制掌握细胞凋亡的特征熟悉研究细胞凋亡的方法学会根据课题需要选择研究方法,一、概 述,（一）细胞死亡的研究历史（二）细胞凋亡的概念（三）细胞凋亡的特征（四）细胞凋亡与细胞坏死,（一）History of cell death research,70s,(1)Cell 1993(H Robert Horvitz)(2)Cell 1993(3)Science 1994(4)Cell 1994(5)Nature 1997(6)Cell
2、1998(7)Cell 1998(8)Cell 1999(9)Nature 2000(10)Nature Cell Biol 2001(11)Nature 2003(12)Cell 2003(13)Cell 2004(14)Nat Chem Biol 2005(15)Cell 2005(16)Science 2005(17)Nat Cell Biol 2007,袁钧英 Yuan J.,1.Cell 1994(Goldstein JL and Brown MS)2.Cell 1996(cytochrome c)3.Science 19974.Cell 19975.Cell 1997 Apaf-1
3、6.Cell 1997 Apaf-1/caspase-9 complex 7.Cell 19988.Nature Cell Biol 19999.Cell 200010.Nature Cell Biol 200011.Nature 2001 12.Science 200313.Cell 200414.Cell 2005,王晓东Wang XD,（二）细胞凋亡的概念,What is apoptosis,a form of cell death in which a controlled sequence of events(or program)leads to the elimination o
4、f cells without releasing harmful substances into the surrounding area Also called programed cell death or cell suicide Necroptosis-programmed necrosis-like death-inhibitor(Nec-1),（三）细胞凋亡的特征,1.形态学特征,细胞体积变小，细胞质浓缩。胞膜结构完整，有泡状突起。细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围。细胞膜内陷形成凋亡小体(Apoptotic bodies)。无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。,细胞膜泡状化（b
5、lebbing）,Caspase 3剪切膜蛋白，干扰膜蛋白的代谢。,2.细胞凋亡的生化特征,染色质DNA断裂,形成180200bp整数倍的DNA片段；细胞内的酶被激活；细胞内活性氧分子增多、胞浆钙离子升高。膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面线粒体膜电位消失，膜通透性变大，细胞色素C被释放。,Shen YX et al,J Pineal Res 2002;32:163-167,(四)Necrosis VS.Apoptosis,二、细胞凋亡的信号通路,（一）内源性通路（线粒体途径）（二）外源性通路（死亡受体途径）:Fas,TNF,Trail.（三）共同终末：caspase激活，启动细胞凋亡进程,（一）
6、内源性通路：线粒体途径（Intrinsic pathway）,Mitochondrial pathway,线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，而且在细胞内源性的死亡信号所诱导的细胞凋亡中处于中心位置。细胞内部的死亡信号源自各种因素，如DNA损伤、氧化应激、X-射线、化疗药物、营养缺乏等。因而，线粒体所介导的凋亡途径又称为细胞凋亡的内源途径。,线粒体介导凋亡的大致过程：损伤因素线粒体跨膜电位（）的消失和线粒体渗透转运孔（PTP）的开放细胞色素C从线粒体中的释放和Caspase-9的激活。,错误造就发现,破碎细胞的时候过于粗暴，线粒体在制备细胞质裂解液中被破坏 如果用凋亡分子刺激细胞，发现细胞色素c的
7、确从线粒体释放到细胞质中-线粒体参与了凋亡的反应 当用细胞色素C的抗体特异地除掉细胞色素c后，细胞质裂解液不能结合dATP,（二）外源性通路（Extrinsic pathway）,1.Fas/FasL pathway,1）Fas/FasL蛋白：Fas又称CD95或凋亡蛋白-1(Apo-1)，分子量约为43kD，成熟蛋白长319氨基酸。胞膜外区有3个富含半胱氨酸的结构域(cysteine-rich domain,CRD)，其中有2个N-糖基化位点。胞浆部分含有70个左右DD(death domain)区。FasL分子量约40kD，成熟蛋白长281个氨基酸。,2）分布：Fas表达比较广泛，胸腺、心
8、脏、肝、肺、肾和卵巢等都有表达。与Fas分布广泛性不同的是，FasL通常只出现于活化的T细胞和NK细胞。3）Fas诱导凋亡的途径：Fas-FADD-Caspase-8FasL与Fas结合后，Fas三聚体化。通过DD区的蛋白质之间的相互作用，Fas与FADD(fas associated death domain)结合，形成DISC(death inducing signaling complex)。通过FADD的DED(death effector domain)区，Procaspase-8 被募集在DISC上。,1.Fas/FasL pathway,Fas-FasL pathway,2.TN
9、F pathway,TNF(Tumor necrosis factor):TNF由活化的单核巨噬细胞产生，亦称恶液质素；TNF由活化的T细胞产生，亦称淋巴毒素。两种TNF的分子量为51kD，结构为同源三聚体，TNF-和TNF-都可以分别与TNFR或TNFR结合，并且与这两型受体的结合基本上没有选择性。,TNFR特点,TNFR又称为TNFR55，胞膜外区有4个CRD，其中有3个N-糖基化位点。胞浆区有3个蛋白激酶C(PKC)作用位点，1个蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位点。TNFR又称为TNFR75，胞膜外区也有4个CRD，其中有2个N-糖基化位点。跨膜区有1个PKC作用位点。TNFR与TNFR
10、在胞膜外区有28%的同源性，在胞浆区没有同源性。TNFR在胞浆区有一个约80个氨基酸的DD区，TNFR没有同样的结构域，但其C端的78个氨基酸残基可以结合信号转导蛋白TRAF2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-2)等胞浆信号蛋白，在信号转导中发挥重要作用。,TNF诱导的凋亡途径,TNFR-TRADD(TNF receptor-associated death domain protein)-FADD-Caspase-8TNF与TNFR结合后，TNFR三聚体化。通过DD区，TRADD 不但可以结合TNFR的胞浆区，也可以结合FAD
11、D的C-端部分。通过FADD的DED区，Procaspase-8 被募集在DISC上。聚集的Procaspase-8或10，通过自身或相互切割产生成熟的Caspase-8或10。,TNFR活化转录因子NF-B的信号也是通过TRADD介导的，TRADD在通过C端部分的DD区与TNFR胞浆区结合后，可以与另一种信号转导蛋白TRAF2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-2)结合，TRAF2 再通过NIKIKKIB通路引起NF-B的活化，使细胞存活。,TNF诱导的细胞存活途径,TNF pathway,3.TRAIL pathway,TRA
12、IL又称凋亡蛋白2配体（Apo2 ligand）;由281个氨基酸组成，分子量32kD;其胞膜外C端区域与FasL和TNF的同源性分别为28%及23%;TRAIL受体：DR4又称Apo-2或TRAILR1，胞膜外区有2个CRD，在C端的胞浆区有DD区，与TNFRI相应的结构域有30%的同源性。TRAILRDR5（TRAILR2），其胞膜外区也有2个CRD，胞浆区有DD区。在正常和肿瘤细胞中，DR4和DR5分布均非常广泛 最显著的特征就是能够选择性杀伤肿瘤细胞而对大多数正常细胞没有明显毒性。,DCR1和DCR2的抗凋亡作用,DCR1（Death decoy receptor1）也被称为TRID(
13、TRAIL receptor without an intracellular domain)。胞膜外区也有2个CRD，与DR4和DR5分别有69%和52%的同源性。但缺少DD区。DCR2的胞膜外区与其他TRAILR相似，但它胞浆部分的DD区不完整。分布：DCR1和DCR2只表达于正常组织，在肿瘤细胞系和转化细胞不表达。DCR1 和DCR2 的抗凋亡作用：DR4、DR5、DCR1和DCR2都可以与TRAIL结合。TRAIL与DR4和DR5的结合可以引起细胞凋亡，而DCR1 和DCR2由于没有胞浆部分或不完整，不能向胞浆中转导凋亡信号，所以DCR1和DCR2与TRAIL结合后，可以保护细胞不发生
14、凋亡。,TRAIL pathway,（三）共同终末：caspase cascade,What is caspases,Caspase：cysteine-containing aspartate-specific proteases A group of cysteine proteases with a crucial cysteine residue that can cleave other proteins,after an aspartic acid residue,a specificity which is unusual among proteases.Caspases are
15、essential in cells for apoptosis.,Caspase的种类,已鉴定的caspase家族成员有14种：人类12种(无caspase-11、-12)小鼠9种(无caspase-4、-5、-9、-10、-13)不参加caspase编序的有：C.elegans的7种蛋白酶 果蝇的5种蛋白酶。,Caspase家族特征,Caspase通常以酶原（Procaspase）的形式存在，相对分子质量为29-49kD。N末端具有一个原结构域（Prodomain）C端包含约20 kD的大亚基和约10 kD的小亚基C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。,根据在细
16、胞凋亡中的作用，Caspases分为两大类：启始Caspase(Initiator):包括-2，-8,-9,-10等，对细胞凋亡的刺激信号作出反应，启动细胞的凋亡过程；效应Caspase(Effector):包括-3，-6，-7等，是在细胞凋亡过程中的具体执行者，完成对特定蛋白底物的水解。,Caspase激活,去除N端原结构域，在大小亚基中进行切割；大小亚基形成异源二聚体，进而形成四聚体。,Caspase cascade,Caspase的效应机制,激活的Caspase可以水解约100个底物，包括细胞调节、细胞信号转导、DNA修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现为凋亡特有的
17、形态学及生化特征：细胞皱缩、断裂，染色质聚集，DNA降解，以及随后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地清除等。,三、重要的凋亡控制基因,BCl-2家族p53IAP家族,1.BCl-2家族,Bcl-2是调节细胞凋亡途径中的一个重要基因。后来又发现许多基因结构与Bcl-2相似，称之为Bcl-2基因家族蛋白产物。根据它们对细胞凋亡作用结果的不同，可将Bcl-2家族成员分为抑制凋亡和促进凋亡两大类。,2.P53,参与DNA损伤而诱发的细胞凋亡 使细胞在G1期停滞：当DNA由于各种原因损伤后，p53首先诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。一旦DNA不能被修复，p53就会活化那些诱导细胞凋亡的基
18、因转录，使细胞发生凋亡。,p21:Cdk inhibitor protein,3.IAP,IAP(inhibitor of apoptosis protein)为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质，首先是从杆状病毒（Baculovirus）基因组克隆到。所有的IAP都含有对抗凋亡作用非常重要的70氨基酸的BIR重复序列（Baculovirus IAP Repeat）。在C末端还拥有一个高度保守的RING序列，因而它们具有泛素（Ubiquitin）E3的活性。,Human cellular IAPs(BIRPs),IAP抗凋亡的机制,通过BIR序列与Caspase蛋白质-蛋白质作用，IAP可以直接抑制
19、Caspase-3、7和9的作用。通过RING序列，IAP可以催化Caspase-3和-7泛素化，导致这些Caspase被proteasome降解。,四、细胞凋亡的检测,（一）形态学分析（二）流式分析（三）原位标记技术（四）DNA降解分析,（一）形态学分析,1.细胞膜结构改变分析,胞膜结构的改变可以改变细胞对一些染料物质的通透性，利用这种通透性及着色结果的差异，可以对坏死和凋亡细胞进行检测。常用方法有：DAPI、PI、PI/FDA法、Hoechst单染、Heochst33342/PI双染等。,DAPI,DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多
20、倍的荧光。和EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。,PI（Propidium Iodide,碘化丙啶）,是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红 PI在绿色光（540nm波长）的激发下，会在600nm
21、（红色光）处发出明亮的荧光。与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍 常用于细胞凋亡或细胞坏死的检测,PI/FDA（荧光素乙酸盐）法,FDA本身不是荧光染料，但可被活细胞摄取，并由细胞内的乙酰酶水解，产物为荧光素。活：绿色 死：红色,Hoechst 染色,为膜通透性染料，凋亡细胞着色浓密激发光波长移动区域长凋亡细胞移动到橙色域,2.细胞内组分改变分析,丫啶橙（AO）AO是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质RNA发桔红色荧光。死细胞核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。lysosome probe：在浓度较低（
22、15mol/L）时对活细胞有较强的染色，其红色荧光的亮度也是反映溶酶体质子泵功能的一个重要参数。凋亡细胞ATP依赖的质子泵并未发生明显的变化，溶酶体结构基本完整，可使AO染料进行累积。坏死细胞失去了溶酶体的完整结构，也失去了积累AO的能力，因而其红色荧光很低。,（二）流式分析,凋亡细胞的重要特点就是染色体基因组DNA的片段化、凋亡细胞的细胞膜通透性增加、小分子DNA的片段丢失。以DNA特异性荧光染料染色后，染色度下降。流式细胞仪分析表现为，DNA着色度低于G1期的细胞，即在细胞周期中出现亚二倍体峰，也叫凋亡峰。,（三）原位标记技术,原位标记是将外源性核苷酸在末端脱氧核苷酸转移酶（Termina
23、l Deoxynucleotidyl Transferase,TdT）和DNA聚合酶I或Klenow大片段的催化下与凋亡细胞的单股或双股断链结合，并能通过一定的显示系统使之显示出来。两种方法：TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记ISNT（In Situ Nick Translation):DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口平移）,（四）DNA降解分析,CAD核酸酶（Caspases-activated DNase）可以造成凋亡时DNA的片段化。在正常情况下，CAD不显示活性，因为CAD以一种无活性的复合物形式（CAD-ICAD）存在。细胞凋亡时，Caspases水解ICAD，CAD就会处于活性状态并最终使DNA片段化。琼脂糖凝胶电泳,Shen YX et al,J Pineal Res 2002;32:163-167,
