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1、荧光显微镜,荧光显微镜的发明,1941年 Coons(昆氏)：将抗体加上萤光染剂用以侦测细胞抗原。这是荧光显微镜的最早雏形。,荧光显微镜的成像原理,荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。,荧光的作用：,荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。,荧光的性质,保持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同
2、程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光染色分类：,自发荧光 二次荧光 抗体荧光技术,自发荧光（不加染色）有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。,二次荧光（用化学染色）非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。,荧光的种类,自发荧光 二次荧光,自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光,染 色,不染色,激发光,发射光,抗体荧光技术（用免疫
3、染色）利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。,荧光显微镜的种类 透射式 落射式,荧光显微镜的分类及构造,一.透射荧光显微镜：光源：高压汞灯或卤素灯。聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。物镜：可用任何种类的物镜。标本：因为是透射观察，薄的标本比较适合。,透射荧光显微镜,汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜,透射荧光显微镜原理,目镜,吸收滤色镜,物镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯,透射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯箱,优点：由于用了暗场聚光镜，激
4、发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。,缺点：必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。厚的或不透明的标本不适用。,不过现在透射式显微镜几乎已经被淘汰，被更先进的反射式（落射式）荧光显微镜所代替。,荧光显微镜,二.反射荧光显微镜：光源：高压汞灯或卤素灯。聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。标本：厚的标本
5、或不透明的标本都能观察。,汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜,荧光显微镜 下的丝状细菌,反射荧光显微镜原理,汞 灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,反射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜激发滤色镜,分色镜,汞灯,紫外线保护罩,孔径光栏（FS）视场光栏（AS）,优点：由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。可以避免不必要的荧光色衰褪现象。,缺点：在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。滤光镜系统
6、必须有效地分离开激发光和荧光。,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色,激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜）,LSCM的发展历史,1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦 显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可 以消除焦点模糊，得到清晰的图像。1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜,传统显微镜的缺憾 在传统的荧光显微镜中，来自汞灯或者氙灯的激发光照射视野中的全部样品，观察者可以用
7、眼睛直接观察，也可以用CCD（电荷耦合器件。CCD是一种半导体装置，能够把光学影像转化为数字信号）等设备直接拍摄荧光图像。传统显微镜得到的图片容易受到轴向干扰和侧向干扰的影响而显得有些模糊。,焦点模糊 对于有一定厚度的样品（大于2微米），一方面，由于在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激发，焦平面上的荧光图像将有一定的模糊，这被称为轴（Z）干扰；另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平面上邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的对比度降低，这被称为侧向（XY）干扰。,共聚焦显微镜优势,共聚焦显微镜很好的解决了传统荧光显微镜中焦面模糊的问题，解决了图像的轴向和侧向的干扰。共聚焦显微镜同时还提供了
8、光切能力，能对厚样品（例如花粉颗粒，果蝇大脑等）进行三维层切成像。,共聚焦显微镜原理简介,共聚焦与传统显微镜的原理差别,照明方式不同：传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟,LSCM采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔
9、。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。,LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管,LSCM的构造,倒置荧光显微镜激光器扫描头系统控制塔电脑及显示器,激光器405nm激光器Ar离子激光器（458nm，488nm，514nm）HE-NE绿激光（543nm）HE-NE红激光（633nm）,扫描头2个荧光探测器一个META探测器一个透射探测器,系统控制塔扫描头控制激光控制数据通信,LSCM的基本特点,观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察,共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用,细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞内氧自由基活性细胞内钙离子浓度变化膜电位,
