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1、五小叶械育苗技术规程1范围本标准规定了五小叶械组织培养育苗的环境及器具灭菌、培养基制备及保存、无菌外植体制备、增殖培养、生根培养、炼苗移栽、容器培育、苗木出圃，同时规定了五小叶械播种育苗的苗圃地选择、圃地准备、播种育苗、苗期管理、苗木出网质量及技术归档。本标准适用于五小叶械在XX省内的组织培养育苗和播种育苗生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6001-1985育苗技术规程GB/T8321.10-2018农药合理使用准则1.Y/T1882-201
2、0林木组织培养育苗技术规程YT/T1000-2013容器育苗技术1.Y/T2289林木种苗生产经营档案1.Y/T2290林木种苗标签3组织培养育苗3.1 组培环境控制3.1.1 准备室消毒灭菌每天用二氧化氯泡腾片或有效氯含量250-350mg/L的84消毒液拖地或擦洗实验台面，操作过程中产生的垃圾及时带出室外并环保处理，保持室内干燥、整洁。3.1.2 贮藏室灭菌每周用二氧化氯泡腾片或有效氯含量250350mg/L的84消毒液拖地一次，每周用臭氧发生器消毒一次，每次30min。3.1.3 接种室灭菌接种前30min,开启房间紫外灯15min。3.1.4 超净工作台使用前按3.1.3的时间点进行紫
3、外灭菌后，台面及内壁四周喷75%酒精。3.1.5 培养室灭菌在完成3.1.2基础上，每周用75%酒精擦洗培养架一次。3.1.6 接种器具灭菌接种盘、镒子、剪刀、手术刀等接种工具在接种前应用纯棉布袋或报纸包裹严实，放置于高压灭菌锅灭菌，灭菌条件：121kPa,121,15min20min.灭菌完成后迅速转移至恒温烘箱烘干备用，烘箱温度通常设置成40C50C。剪刀、锻子等使用前需用酒精灯灼烧或接种工具灭菌器进行富温灭菌。3.1.7 培养基灭菌按照LY/T1882-2010操作执行。3.1.8 菌瓶处理贮藏室、培养室等环境应长期保持干燥、整洁，发现菌瓶应立即清除，高温消毒后再行清理。3.2 培养基配
4、制与保存3.2.1 培养基选择五小叶械组织培养使用到两种基本培养基，MS基本培养基和DKW基本培养基，在不同阶段使用的培养基见附录A和附录Bo3.2.2 母液配制与保存3.2.2.1 母液成分母液分为含氮（N）、磷（P）、钾（K）,钙（Ca）、镁（Mg）的大量元素，含碘、硼（B）、锌（Mn）、锌（Zn）、铜（Cu）、铝（Mo）、钻（Co）、银（Ni）的微量元素，含肌醇、盐酸I此哆醉、烟酸、L-抗坏血酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、生物素、D泛酸钙、烟酸硫胺素的有机营养成分，含硫酸亚铁与乙二胺四乙酸二钠形成的络合物的铁盐，含6-节氨基噪吟（6-BA）、蔡乙酸（NAA）、口引咪-3-乙酸（IBA）的植物
5、生长调节剂。3.2.2.2 水质要求母液配制用蒸储水、去离子水或超纯水。322.3大量元素配制每个组分应单独溶解充分后，再按N、P、K、Mg、Ca顺序依次混入，每加一个组分与前溶液充分混合后再加入下一组分。3.2.2.4母液浓度大量元素母液各组分浓度是培养基中相应大量元素组分浓度的40倍，微量元素母液是培养基中相应微量元素组分浓度的200倍，有机营养母液是培养基中相应有机组分浓度的200倍，铁盐母液是培养基中相应铁盐组分浓度的200倍，植物生长调节剂用1mol/LNaOH助溶后配成0.2mg/L的母液。322.5母液保存母液容器上贴标签，注明名称、浓度倍数、配置日期、配置人员。微量元素和有机营
6、养成分母液应用棕色瓶分装。所有母液至于4C冰箱保存，贮藏时间不超过90d,如发生沉淀或有微生物、藻类生长，立即弃用。3.2.3培养基配制与保存（以IL增殖培养基的配置方法为例）3.23.1准备制备前准备好去离子水、蔗糖、卡拉胶、各种母液，准备好电磁炉、不锈钢锅、移液枪、量筒、分析天平、药勺、PH计等器具。3.23.2糖和X脂称取用分析天平称取蔗糖30g,卡拉胶6g,置于不锈钢锅内。323.3母液量取与定容量筒量取大量元素母液25mL,微量元素5mL,有机营养成分5mL,铁盐5mL,移液枪量取6-BA1.25mL,NAA0.25mL,量筒量取去离子水958.5mL。3.2.3.4溶解定容好的培养
7、基用玻璃棒轻轻搅拌均匀，置于电磁炉上加热，加热期间用玻璃棒朝同一方向持续轻轻搅拌，避免糊底，直至蔗糖、卡拉胶完全溶解。3.235PH测定和调节用PH计测量培养基酸碱度，用ImolzLHCl和1mol/LNaOH调节PH值至5.86.0。323.6分装用培养瓶定量分装，培养基厚度1.5Cm2.0cm。操作时切勿将培养基撒到瓶口，分装完后立即盖好瓶盖，并注明培养基种类代码和日期。3.23.7灭菌配好的培养基应在6h内完成灭菌，灭菌条件参照3.1.7。3.238保存灭菌完成的培养基应及时从灭菌锅中取出，立即通过专用通道转入培养基储藏室。培养基储藏室温度应W2（C,培养基应在30d内用完。3.3无菌外
8、植体制备3.3.1 母树选择在五小叶械林分中选择姿态挺拔、侧枝稠密，生长旺盛且无明显病虫害的单株。3.3.2 外植体选择优良单株当年生半木质化顶芽或侧芽。3.3.3 外植体采集3.3.3.1 采集时间五小叶械外植体采集季节宜选择在春、夏两季，此时萌条抽出、枝条生长旺盛。采集时间宜选择连续天晴3d以上的上午。333.2 枝条要求生长健壮、腋芽饱满、无明显病虫害的当年生枝条。333.3 外植体处理、保存、运输若无需运输，采集的半木质化枝条剪去所有叶片、木质化枝条保留枝条上端1/3处以上的叶片，直接带回组培室；若需长途运输，需用洁净保鲜膜包裹上述处理好的材料（木质化枝条留叶部分裸露在外）置于保温箱中
9、运回组培室。保温箱中应有防撞气泡垫包裹的冰袋。五小叶械的外植体从采集到接种应在48h内完成。333.4 外植体表面消毒3.3.4.1预处理枝条条置于自来水下冲洗5min后，用1洗洁精的溶液中浸泡3min,细毛刷轻轻刷去表面污垢，流水冲洗干净，再用无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干表面水分，至于超净工作台备用。3.342表面消毒用已消毒的剪刀将预处理的外植体分成小段，每段带12个芽，把芽投入装有0.1%HgCl2溶液的玻璃瓶中消毒IOmin,期间每隔2min稍稍用力摇晃玻璃瓶。无菌水清洗5遍,用灭菌滤纸吸干表面水分后接种。33.4.3初代培养把消毒后的外植体竖直或倾斜插入培养基中间，节间均露于培养基面上，每瓶只接种一个外植体。接种完瓶上注明编号和日期。初代培养基配方为：MS+30gL蔗糖+7gL卡拉胶+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。接种后，材料宜暗培养15d后，再光照培养（1500lux、光周期10hd）,培养温度232C苗WCm根系地径mm苗高cm根系长度cmM5cm长I级侧根数长度cmM5cm长I级侧根数组培苗1-0655854.54564顶芽饱满，无损伤，色泽正常，充分木质化XX实生苗86510565585顶芽饱满，无损伤，色泽正常，充分木质化XX
