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1、牛5种病毒性腹泻病诊断和防治技术规程1范围本标准规定了牛病毒性腹泻黏膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛纽布病毒和牛诺如病毒共5种病毒引起的牛病毒性腹泻病临床诊断和防治技术。本标准适用于上述5种腹泻相关病毒的检测，病毒性腹泻病诊断、疫情处理、预防与控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T18637-2018牛病毒性腹泻粘膜病诊断技术规范GB/T19489实验室生物安全通用要求NY
2、/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1牛病毒性腹泻黏膜病Bovineviraldiarrhea-mucosaIdisease牛病毒性腹泻黏膜病(BOVineviraldiarrhea-mucosaldisease,BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病W(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)感染引起的一种病毒性传染病。BVDV可引起牛呼吸道综合征、繁殖障碍性疾病、腹泻/黏膜病、免疫抑制和持续性感染等。该病呈全球性流行，在养牛业发达国家危害尤为严重，造成全球乳/肉牛业严重的经济损失。在我国，BVD是进口动物检疫的
3、二类传染病和跨省交易运输必检的疫病。BYDV是单股正链RNA病毒，基因组约为12kb13kb.整个基因组由三个部分组成，可分为5端非编码区(5untranslatedregion,5,UTR)开放阅读框架区(openreadingframe,ORE)和3端非编码区(3,untranslatedregion*3UTR)O4. 2牛轮状病毒病BovineRotavirusdisease牛轮状病毒病是由牛轮状病揖(BovineRotavirus,BRV)引起的以呕吐、腹泻、脱水等为主要特征的人畜共患急性胃肠道传染病，尤其在幼龄动物中高发。该病已在全世界主要养牛国家和地区普遍发生和流行，给养牛业造成了
4、严重的经济损失。BRV为呼肠孤病毒科轮状病毒属，无囊膜双链RNA病毒，分11个基因节段，分别编码6种结构蛋白(VP1VP4VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1NSP6)。5. 3牛冠状病毒病BovineCoronavirusdisease牛冠状病毒病是由牛冠状病毒(BoVineCoronavirus,BCoV)引起的新生犊牛腹泻、成年牛冬季腹泻和各年龄段牛呼吸道疾病。BCoV为不分段的单股正链RNA病毒，有囊膜。基因组全长大小介于30847bp31100bp,具有2个开放阅读框ORFla和ORFIb,五种主要的结构蛋白：纤突蛋白(三)、血凝素/酯酶蛋白(HE).核衣壳蛋白(N)、跨膜蛋白
5、(M)和小膜蛋白(E)。6. 4牛纽布病毒病Nebovirusdisease牛纽布病毒病是由纽布病毒(Nebovirus,NeV)引起犊牛腹泻的疾病。NeV为单股正链RNA病毒，根据其重组酶聚合酶(RdRp)基因序列，NeV可以分为NBTike、NAl-Iike和Dijon216-like3种基因型；根据其完整VPl基因序列，NeV可以分为2个基因型(基因1型和基因2型)，其中基因1型又细分为4个谱系(谱系14)。7. 5牛诺如病毒病Bovinenorovirusdisease牛诺如病毒病是由牛诺如病毒(BOVinenOrOVirus,BNoV)引起的一种犊牛腹泻的疾病。NOV属于杯状病毒科，
6、诺如病毒属，是单链的RNA病毒，基因组全长7.37.5kb。根据其基因特征，可将NoV分为6个基因型。4诊断7.1 临床症状感染牛主要表现为体温升高，精神沉郁，食欲减退或废绝；多数病牛出现不同程度的腹泻，排出水样稀粪，内有气泡、粘液或血，气味恶臭；病牛甚至迅速脱水，死亡。7.2 荧光定量RT-PCR鉴定腹泻相关病毒4. 2.1样本采集与处理采集肛门棉拭子510g,置RNA保存液，-20C及以下保存运输不超过48h,提取并反转录合成CDNAo8. 2.2样本检测依据本标准附录A中提供的牛病毒性腹泻粘膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛纽布病毒和牛诺如病毒荧光定量RT-PCR或iiPCR方法鉴定5
7、种主要的牛腹泻相关病毒。5防治措施8.1 隔离：发现疑似疫情，立即隔离患病动物。8.2 消毒：对病牛污染的场所、用具、物品彻底消毒。8.3 对症治疗：采取补液、强心、止泻和防止细菌继发感染等措施治疗患病动物。5. 3.1补液：复方氯化钠或生理盐水，重症者输注5%葡萄糖生理盐水或一定量的10%低分子右旋糖酎补液。5. 3.2强心：在补液同时选用毛花苔C、洋地黄毒甘、毒毛旋花昔K等强心剂强心。5. 3.3止泻：每头牛口服碱式硝酸1530g形成一层薄膜保护肠壁止泻。9. 3.4防止细菌继发感染：单一或联合使用嗖诺酮类、氨基糖昔类、头胞类磺胺类或酰胺醇类抗菌药物等广2种防止细菌继发感染，采用肌肉注射或
8、静脉注射。9.1 特异性抗体治疗：高免血清或卵黄抗体对发病牛紧急治疗，对受威胁牛紧急预防。9.2 疫苗紧急免疫：牛病毒性腹泻相关病毒疫苗紧急免疫预防。6无害化处理患病牛及其产品按照“农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范”进行无害化处理。附录A（规范性）牛5种腹泻病毒荧光PCR检测方法及结果判定A.1引物及探针（IOUmOl/L）NeV-F：5-CAGeCCGTCTGGGTGAAT-3；Nev-R：5-Ctggatrgttctgacttcggt；BNoV-F：5,-CCTYCACGGCGAGAAGTT-3,bnov-r：5,-Cggwgcgatggtacaaarat-3,BCoV-F：
9、5,-AGTAGTGTCAGTGCTAAC-3,BCoV-R：5,-CAAGTGCCTGTAGGTATA-3,BCoV-Probe:5-FAM-CCTTCCTCCCGCCA-TMR-3,BVDV1-F：5,-AAGCCTCGAGATGCCACG-3,；BVDV1-R：5,-GCGCCCCTTCGGCTGT-3,；BVDVl-Probe:5-FAM-CCCACAGCACATCTTAATGB3BRv-F：GctaaccacttggtatccgBRV-R：GccatctgagtgattactctgBRV-Probe：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1A.2牛5种腹
10、泻病毒荧光PCR检测方法及结果判定A.2.1NeV染料法real-timePCR检测A.2.1.1反应体系及条件反应体系：TBGreenPremixExTaqII10L,上、下游引物各1.0L,CDNA模板1.5L,用DEPCH20补齐到20uL。反应条件为：951min；9515s、5130s,共40个循环；熔解段950C15s、60*C1min、95,15s,1个循环，反应结束。A.2.1.2结果判定A.2.1.2.1阈值设定检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好
11、超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。A.2.1.2.2质控标准阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0,出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，熔解曲线于84C左右未出现明显的峰值。阳性对照Ct值30.0,并出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88左右出现明显的峰值。否则，此次检测结果判定为无效。A.2.1.2.3结果描述及判定无Ct值，且无典型的扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0,出现扩增曲线，但熔解曲线于88C左右未出现明显的峰值，表示样品中无病毒核酸，判定为阴性。Ct值W35.0,出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88C左右出现明显的峰值，表示样品中存在病毒核酸，
12、判定为阳性。30. 0Ct值35.0,且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则判为阴性。A.2.2BNoV染料法real-timePCR检测A.2.2.1反应体系及条件反应体系（20L）：TBGreenPremixExTaqII10L,上、下游引物各1.2L,CDNA模板L5L,用DEPCH20补齐到20jL,反应条件为：952min；95t15s、57.420s,共40个循环；熔解段9515s、601min、95,15s,1个循环，反应结束。A.2.2.2结果判定A.2.2.2.1阈值设定检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值
13、直接读取检测结果，Ct值为每个反应管的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。A.2.2.2.2质控标准阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；或阴性对照Cl值35.0,出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，熔解曲线于84C左右未出现明显的峰值。阳性对照Ct值30.0,并出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88C左右出现明显的峰值。否则，此次检测结果判定为无效。A.2.2.2.3结果描述及判定无Ct值，且无典型的扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0,出现扩增曲线，但熔解曲线于88C左右未出现明显的峰值，表
14、示样品中无病毒核酸，判定为阴性。Ct值W35.0,出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88左右出现明显的峰值，表示样品中存在病毒核酸，判定为阳性。30. OCt值35.0,且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则判为阴性。A.2.3BCoV探针法real-timePCR检测A.2.3.1反应体系及条件PCR反应体系:ProbeqPCRPremixExTaq10L,探针P4L(10molL),上下游引物各0.8L(10molL),CDNA模板2L,DEPCH20补足至120L反应程序为：952min；9515s,5420s(采集荧光)，
15、40个循环。A.2.3.2结果判定A.2.3.2.1阈值设定阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。A.2.3.2.2质量控制阴性对照：FAM通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线，TAMRA通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线。阳性对照：FAM通道CT值W35,TMR35,且2个通道扩增曲线均为典型的S型。上述阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。A.2.3.2.3结果描述及判定被检样本检测结果中FAM通道Cl值W36,TAMRA通道W36,且扩增曲线均为典型的S曲线，报告为BCoV核酸阳性；36Cl值
16、40,判定为可疑，可疑样品应重新检测，如重复后仍为36Cl值40,且扩增曲线均为典型的S曲线，报告为BCOV核酸阳性。被检样本检测结果中FAM和TAMRA通道均无CT值或无典型的S型扩增曲线，报告为BCoV核酸阴性。A.2.4BVDV1型iiPCR检测A.2.4.1反应体系及条件反应体系：Taq酶IuL,预混BuIfer25uL,引物上下游各3.5UL(10molL-I),探针0.3HL(10molUL-D,反转录酶L5uL(20UuL-l),CDNA模板2uL,DEPCH2013.2PL,共50PLo反应条件：42,30min,93,15sec,60,1min,40个循环。反应信号由iiPC
17、R仪光学探测模块自动识别，其反应结果通过系统默认的S/N值进行计算并被转化为“+”(positive),(negative)和“？”(inconclusive)显示在屏幕上。A.2.4.2结果判定A.2.4.2.1质量控制阴性对照：经HPCR反应，结果显示为。阳性对照：经iiPCR反应，结果显示为“+”,上述阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。A.2.4.2.2结果判定被检样本检测结果中，iiPCR仪显示为者判定为阳性；iiPCR仪显示为“-”判定为阴性。A.2.5BRViiPCR检测A.2.5.1反应体系及条件反应体系：Taq酶IuL,预混BUf
18、fer25uL,引物上下游各3.5UL(IOUnloluL-1)、探针0.25L(10molPL-D、反转录酶1.25UL(20UuL-l)、CDNA模板2uL、DEPCH2013.5uL,共50pLo反应条件：42,30min,93,15sec,60,1min,40个循环。A.2.5.2结果判定A.2.5.2.1质量控制阴性对照：经HPCR反应，结果显示为。阳性对照：经iiPCR反应，结果显示为“+”。上述阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。A.2.5.2.2结果判定被检样本检测结果中，iiPCR仪显示为“+”者判定为阳性；iiPCR仪显示为“-”判定为阴性。参考文献农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范。
