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1、碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌耐药性分析及分子流行病学研究何秀娟1,宋其华1,田家辰2,叶惠娟I,王红I,陈胜男11 .北京市昌平区医院检验科，北京，1022002 .内蒙古自治区锡林郭勒盟太卜寺旗旗医院检验科，锡林郭勒盟，027(XX)目的:探讨碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbanannii,A.baumanni)的耐药性及分子流行病学，为院内感染控制及临床合理用药提供理论依据。方法:.对我院临床分离的47株非重复性碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌，用VlTEK2Compact分析系统检测药物敏感性，应用多位点序列分型(MUItiIOCUSSeqUenCetyPing,MLST)技术
2、进行分子流行病学研究，应用eBURST软件对多位点序列分型结果进行分析。结果：47株鲍曼不动杆菌主要来源于痰标本(38,80.9%)：临床科室分布在内科重症监护病房(MICU)(31,66%)、呼吸科(5,10.6%)、重症监护病房(ICU)(4,8.5%)等；抗菌药物敏感率除阿米卡星81.4%、复方新诺明41.9%、替加环素40%之外，其他检测药物的敏感率均低于5%；经扩增得到4种ST分型，以ST208(25株，53.2%)、STl95(19株，40.4%)为主，经eBURST分析都属于克隆复合体92(。OnalComPIeX92,CC92)。结论：碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌对大多数抗菌药物的
3、耐药率很高，CC92克隆株在医院流行播散，临床要重视碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌感染的预防和控制。关键词:鲍曼不动杆菌、耐药性、多位点序列分型AnalysisofantimicrobialresistanceandmolecularepidemiologyofCarbapenemresistantAcinetobacterbaumanniiHEXiu-juanl,SONGQi-hual,TIANJia-chen2,YEHui-juanl,WANGHong1,CHENSheng-nan11.ChangpingHospital,Beijing,1022002.XilinGolLeagueinInner
4、MongoliaAutonomousRegion,TaipusiBannerHospital,027000Objective:ToinvestigateantimicrobialresistanceandmolecularepidemiologyofCarbapenemresistantAcinetobacterbaumanniiandprovidetheevidenceofthecontrolofnosocomialinfectionandrationaluseofantibiotics.Methods:Thedrugsensitivityof47nonrepetitiveCarbapene
5、mresistantAcinetobacterbaumanniiwasdetectedbyVITEK2Compact.ThemolecularepidemiologywasstudiedbyMultilocussequencetyping(MLST)andeBURSTsoftware.Results:47strainsofAcinetobacterbaumanniiisolatedfromsputumspecimens(38,80.9%)；TheclinicaldepartmentsweredistributedinthemedicalintensivecareUnit(MICU)(31,66
6、%)respiratorydepartment(5,10.6%)andintensivecareunit(ICU)(48.5%),etc.47strainsofAcinetobacterbaumanniiweresensitivetoamikacin81.4%,41.9%totrimethoprimsulfamethoxazoleand40%totegacycline.Thesensitivityofotherdrugswasless(han5%,4typesofSTtypeswereamplifiedbyamplication.withST208(25.53.2%)andST195(19,4
7、0.4%).EBURSTanalysisfoundthattheSTtypesbelongedtotheclonecomplex92(ClonalComplex92,CC92).Conclusions:theresistanceofCarbapenemresistantAcinetobacterbaumanniitomostantibioticsisveryhigh,andCC92cloneiswidelydisseminatedinhospitals,AttentiontothepreventionandcontrolofCarbapenernresistantacinetobacterba
8、umanniiinfection.Keywords:Acinetohacterbaumannii,antimicrobialresistance,MLST鲍曼不动杆菌是我国院内感染的重要条件致病菌之一，随着抗菌药物的普遍使用，碳育霉烯耐药鲍曼不动杆菌(CarbapenemresistantAcinetobacterhaunannii,CRAB)的检出率和耐药性在逐年上升。中国细菌耐药监测研究2017至2018年革兰阴性菌监测报告显示，鲍曼不动杆菌对多数被测药物的耐药率大于70%,对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率约在70%,耐药率低于30%的抗菌药物不多，依次为多黏菌素E(3.3%)、替加环素(11
9、.0%)和米诺环素(27.3%)1,o本研究主要对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌进行药物敏感性分析和同源性分析，为我院临床治疗和院感控制提供重要的理论依据。1材料与方法1.1 菌株来源收集本院2017-2019年住院和门诊患者分离鲍曼不动杆菌200株，其中碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌47株，2017年12株(34.1%)、2018年19株(40.4%)和2019年16椒25.5%),已剔除了同一患者的重复菌株。所有菌株经Vitek2Compact分析系统鉴定，确定为鲍曼不动杆菌。药物敏感性试验的质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853o1.2 方法1.2.1 药敏试验采用V
10、ilek2Compact分析系统测定所有菌株对抗菌药物(头抱替坦、头袍他咤、头抱曲松、头抱毗后、环丙沙星、左旋氧氨沙星、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、氨节西林/舒巴坦、替加环素、阿米卡星)的最低抑菌浓度(minimalinhibitionconcentration,MIC)o根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2019判断标准进行药物敏感性判断，其中替加环素结果参照美国食品药品管理局(FOodandDrugAdministration,FDA)判读标准，MIC2ug/ml为敏感，MIC28ugml为耐药。应用Whonet5.6软件进行耐药率的统计分析。1.2.2 提取DNA采用煮沸法提
11、取菌株DNAo先在无菌管内加入200ul无菌水，从血平板上刮取适量新鲜培养的菌落进行稀释，水浴IO(TClo分钟，然后以12000rmin的速度离心IOmin,取上清液于另一干净无菌的管中，即为所需DNA,放置20冰箱保存。1.2.3 多位点序列分型(Multilocussequencetyping,MLST)用PCR扩增鲍曼不动杆菌MLST的7个管家基因fltA.gyrB.gdhB、recA、CPn60、gpi和toD,310引物序见表1.表1鲍星不动杆菌MLST分型引物序列和产物大小Primer名称引物序列StO3，)产物大小(bp)gitA-?AATTTACAGTGGCACATrAGGT
12、CCC723gARGcagagataccagcagagatacacggyr-FGaatgctggtgtacgtatcg775XyrB-RAcgctcaacgttcaggatctrecA-FCctgaatcttctggtaaaac425wc-RGtttctgggctaccaaacataaccpn60-FActgtacttgctcaagc480cpn60RTtcagcgatgataagaagtggroDFCtaagcgttcgcctaactctrpoDRCtcaagtagcggctctgattgdhbFTggccagccatagttaccacgdhbRAtgctttgttatgggggccagpi
13、-FGaaatttccggagctcacaagpi-RTcaggagcaataccccactc1479713386所有PCR产物送擎科测序公司进行测序。将测序结果在鲍曼不动杆菌数据库，可获得各管家基因对应的等位基因编号。将各菌株管家基因的等位基因编号按顺序gltA-gyrB-gdhb-rec-cpn60-gpi-rpoD排列组合，每个组合获得个对应的序列型（SeqUenCetype,ST）,以此标识每株菌株的分型。应用eBURST软件对获得的ST型数据进行进化关系分析。2结果2.1 菌株基本特征：47株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌来源于2017-2019年临床分离菌株，12株来源于2017年（34
14、.1%）、19株来源于2018年（40.4%）和16株来源于2019年（25.5%）。三年来碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）的发生率逐年上升，由18.2%增加到28.1%,不同年份碳育霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）发生率及科室分布情况见表2。47株鲍曼不动杆菌的标本类型以痰液（38株，80.9%）为主，还包括全血（4株，8.5%）、肺泡灌洗液（3株，6.4%）.分泌物（1株，2.1%）和脑脊液（1株，2.1%）。分离的菌株主要来源于老年男性患者，男性27株，占57.4%；女性20株，占42.6%。按年龄，265岁有41株，占87.2%；38-64岁有6株，占12.8%。表247株碳青霉烯
15、耐药鲍曼不动杆菌发生率及临床科室株数分布年份AB株数CRABCRAB不同科室的株数（株）（株）发生率MICU呼吸ICU肿瘤综合内科心内二骨二中医科合计2017年6618.2%8I111122018年7724.7%1213111192019年5728.1%1131116合计20023.5%315422111472.2 药敏试验结果：47株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌对头衔替坦、头狗他咤、头抱曲松、头孑包毗后、环丙沙星、氨苇西林/舒巴坦、庆大霉素、妥布霉素、左旋氧氟沙星、复方新诺明、替加环素、阿米卡星的耐药率分别为100%、100%、100%、Io0%、Io0%、97.4%、95.3%、93%、81.
16、4%、58.1%、40乐18.6%。见表3。表347株碳吉霉烯耐药篦及不动杆菌药物敏感性抗生素名称R(%)1(%)S(%)头抱药坦10000头抱他喔10000头抱曲松10000头抱吐强10000环丙沙星10000氨苇西林/舒巴坦97.42.60庆大霉素95.32.32.3妥布霉素932.34.7左旋氧城沙星81.416.32.3史方新诺明58.1041.9替加环素402040阿米卡星18.6081.4R：表示耐药，S：表示敏感，I表示中介。2.3 MLST分型结果：MLST分析获得4种ST分型，以ST2O8和ST195为主，分别占53.2%和40.4%,其次为ST369(4.3%)和ST523
17、(2.1%),ST类型位点信息见表4。eBURST分析发现4个ST型均属于克隆复合体92(。Onalcomplex92,CC92),这些ST型之间仅相差一个管家基因(gp)或两个管家基因(期田、gpi),具有较近的亲缘关系。表42017-2019年分离的CRAB的ST类型位点信息STgAgyrBgdhBrecAcpn60gpirpoD2081332297319513322963369I332210635233333225()33讨论近年来，临床上分离的重要耐药细菌，尤其以革兰阴性杆菌为主的多重耐药细菌的检出率呈逐年快速上升的趋势，为临床抗感染治疗带来了巨大的挑战上咒2017年世界卫生组织(WH
18、o)发表了首份抗生素耐药“重点病原体”清单，其中碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌被列为“极为重要”的新型抗生素研发重点病原体。本研究收集2017-2019年我院临床分离非重复鲍曼不动杆菌200株，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌47株，发生率为23.5%,低于李荷楠等的报道M,但有逐年增长的趋势。47株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌标本来源分布广泛，以痰标本为主(占80.9%),与相关报道一致c791o其临床科室来源以MICU(占66%)为主，主要感染免疫力低下的危重症患者，也与相关报道相符”号47株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的药敏试验显示，临床常用的第三代、第四代头抱菌素、氨瞳诺酮类和氨基糖甘类等抗生素均具有极高的
19、耐药率；碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药率为40%,也应引起足够的注意，姚丹玲等加指出，替加环素联合其他抗菌药物治疗并没有明显减少病人28天的病死率，这些都给临床治疗带来了极大困难。多位点序列分型(MUIliloCUSSequenceTyping,MLST)是基于核酸序列进行细菌分型的方法，其操作比较简单，重复性也高，对长时期内和大范围的分子流行病学调查非常适用本研究经多位点序列分型共获得4种ST分型，以ST208和ST195为主，分别占53.2%和40.4%,均属于中国流行克隆CC92,且暂未发现新的克隆菌株。CC92是多重耐药鲍曼不动杆菌最主要的克隆复合体，在全球范围内广泛流行，己
20、在我国多个地区和不同医院分离到t,2l43。不同ST分型在国内分布呈现地理差异性，研究我院碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌分离株的种群结构对于预防感染暴发十分必要，每个地区除了要预防本地流行菌株的暴发外，防止外来流行克隆株的入侵同样是要重点关注的方向。本研究表明，我院碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的检出率在逐年升高，耐药形势也不容乐观，定期进行流行病学监测有助于了解碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌暴发流行的情况，能更好地为临床诊治提供依据，利于医院院感防控措施的制定与执行。参考文献：李耘，吕媛，郑波，等.中国细菌耐药监测研究2017-2018革兰氏阴性菌监测报告J中国临床药理学杂志,2019,35(19)：2508
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