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1、维生素Bl（VitaminBl,VBl）试剂盒说明书微量法100T/96S注意r正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：维生素Bl（VitaminBD是构成脱按辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三枝酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。测定原理：VBl在碱性条件下还原铁甄化钾生成亚铁甄化钾，亚铁轨化钾与Fe?+在弱酸条件下生成普鲁上蓝，在704nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器：天平、研钵、离心机、可见分光光度计/函标仪、微量石英比色皿白6孔板、恒温水浴锅、蒸储水。试剂组成和配制：提取液:液体70mLl瓶,49保存。试剂一：液体ImL
2、xl瓶,46保存。试剂二：液体2mll支，4C保存。试剂三：液体2mll瓶，4C避光保存。试剂四：液体5mLl瓶，4C保存。试剂五：液体3mll瓶，4C避光保存。样本处理：1 .组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积（mL）为1：510的比例（建议称取约O.lg,Ira入0.6ml提取液）加入提取液，60C浸提30min,加蒸储水0.4ml,混匀后于25,1600OrPm离心Iomin,取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心253Omin）O2 .细胞：按照细胞数量（IO,个）：提取液体枳（mL）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎
3、细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）：加蒸储水0.4mL,混匀后于25C,1600OrPm离心IOmin,取上清测定。3 .血清：直接测定。测定操作I空白管测定管样品（L）20试剂一（L）20试剂二（L）1616试剂三（L）2020充分混匀，80七反应IOrnin提取液（L）1616试剂四（L）4444试剂五(HL)2424H2O(L)6060充分混匀，静置20min,于微量石英比色皿白6孔板，蒸镭水调零，测定704nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，AA=A测定管A空白管。计算公式Ia.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=0.017+0.31,R2=0.99
4、91；X为标准品浓度：gmL;y为AA(A测定管-A空白管)1 .按照蛋白含量计算VBl含量(gmgprot)=(A-0.0031)0.017Cpr=58.8(A-0.31)Cpr2 .按照样本质量计算VBl含量(gg鲜重)=(A-0.0031)0.017(WV样总)=58.8(A-0.31)W3 .按照细胞数量计算VBl含量(g104cell)=(A-0.0031)0.017(细胞数量V样总)=58.8(A-0.0031)细胞数量4 .按照液体体积计算VBl含量(gmL)=(A-0.0031)0.017=58.8(A-0.0031)V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL
5、；W：样本质量，gb.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线:y=0,85x+0.0031,R2=0.9991：X为标准品浓度:gmL:y为AA(A测定管A空白管)1 .按照蛋白含量计算VBI含量(gmgprot)=(A-0.31)0.0085Cpr=117.65(A-0.0031)Cpr2 .按照样本质量计算VBl含量(gg鲜重)=(A-0.0031)0.85(WV样总)=117.65(A-0.0031)W3 .按照细胞数量计算VBl含量(g104cell)=(A-0.0031)0.85(细胞数量+V样总)=117.65(A-0.0031)细胞数量4 .按照液体体积计算VBl含量(gmL)=(A-0.0031)0.0085=117.65(A-0.0031)V样总：加入提取液体积，1ml：Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g注意事项，1 .若测定结果中吸光值超过2,请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。2 .蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再重新测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。3 .显色完成后立即进行测定。4 .标准曲线线性范围为0.1-10gmLo
