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1、维生素B6(VitaminB6,VB6)试剂盒说明书微法1OOT/96S注意:正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义:维生素B6(VitaminB6)又称毗哆素,其包括毗哆醉、毗哆醛及毗哆胺,在体内以磷酸酯的形式存在,是一种水溶性维生:素,在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢,对生物体具有极其重要的作用。测定原理:VB6与4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物,在390nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器:天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸储水。试剂组成和配制:提取液:液体70mLl瓶,4保存。试剂一:液体ImL
2、Xl瓶,4*C保存。试剂二:液体5mLl瓶,4C保存。试剂三:液体8mLl瓶,4C避光保存。试剂四:液体8mlXL瓶,4C避光保存。样本处理I1 .组织:将样品磨碎,按照质量(g):提取液体积(mL)为L510的比例(建议称取约Olg,加入0.6ml提取液)加入提取液,60C浸提30min,加蒸储水0.4mL,混匀后于25,1600OrPm离心IOmin,取上清测定(动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟)。2 .细胞:按照细胞数量(IO4个):提取液体枳(mL)为5001000:1的比例(建议500万细胞加入0.6ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒
3、,总时间3min):加蒸储水0.4mL,混匀后于25C,1600OrPm离心IOmin,取上清测定。3 .血清:直接测定。测定操作I空白管测定管样品(UL)40试剂一(HL)40试剂二(L)4040试剂三(L)6060试剂四(HL)6060充分混匀,25C反应20min,于微量石英比色皿杓6孔板,测定39Onm处吸光值,记为A空白管和A测定管,4A=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。计算公式,a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线:y=0.3635x+0.0205,R2=0.99861 .按照蛋白含量计算VB6含量(gmgprot)=(A-0.0205)0.3635xV反总(V样X
4、CPr)=13.76(A-0.0205)Cpr2 .按照样本质量计算VB6含量(gg)=(A-0.0205)0.3635V反总(V样WV样总)=13.76(A-0.0205)W3 .按照细胞数量计算VB6含量(g104cell)=(A-0.0205)0.3635xV反总(V样X细胞数量V样总)=13.76(A-0.0205)细胞数量4 .按照液体体积计算VB6含量(gmL)=(A-0.0205)0.3635V反总V样=13.76(A-0.0205)V反总:反应总体积,0.2mL;:V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:加入提取液体积,1mL:Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,gb
5、.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线:y=0.1818x+0.0205,R2=0.99861 .按照蛋白含量计算VB6含量(gmgprot)=(A-0.0205)+0.1818xV反总(V样XCPr)=27.52(A-0.0205)Cpr2 .按照样本质量计算VB6含量(gg)=(A-0.0205)0.1818xV反总(V样WV样总)=27.52(A-0.0205)W3 .按照细胞数量计算VB6含量(g104cell)=(A-0.0205)0.1818V反总(V样X细胞数量V样总)=27.52(A-0.0205)细胞数量4 .按照液体体积计算VB6含量(gmL)=(A-0.0205)0.1818V反总V样=27.52(A-0.0205)V反总:反应总体积,0.2mL:V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:加入提取液体积,1mL:Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g注意事项1 .若测定结果中吸光值超过1,请将样本稀释后进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。2 .蛋白浓度较高的样品,比如动物组织,若显色完成后有沉淀产生,将样本稀释后再测定,在计算公式中乘以稀释倍数。3 .显色完成后立即进行测定。