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1、液相色谱质谱联用仪的使用(AgilentLC-QQQ6490)文件编号:版次/修订次:编写:日期:审核:批准:批准日期:文件修订记录表修改序号修改章节号修改内容修改申请人批准人批准日期1初稿作成初版制作。年XX月XX日主要内容:仪器型号AgilenlLC-QQQ6490硬件组成色谱系统、质谱系统软件组成数据采集系统、定性软件、定量软件方法建立材料的准备、初步方法的建立、方法的优化关机三大步一、仪器硬件组成1.色谱系统1.1流动相A.水溶剂：A1：纯水（避光，常更换，防止细菌滋生）A2：甲酸水、氨水等B.有机溶剂B1：纯乙盾、纯甲醇、纯异丙醇B2：含0.1%的甲酸乙月青溶液注：流动相越简单越好，
2、避免加入无机盐（如HzSOQ甲醇与乙三的比较：甲醇：与水相溶会发热；延滞性大，便宜；乙睛：溶解性不佳，乙月青会结晶；极性、溶解性和延滞性极性：水甲醇乙睛；延滞性（表面张力）：水甲醇乙月青；洗脱能力：甲醇、乙月青水流动相的配置：水相流动相通过022m的膜以达到去除颗粒的目的。超声（1020min）以去除气泡；滤头应定期更换1.2 色谱柱保护套（漉头、套管）注：进口：用扳手拧，出口管路应多留出一段），安装柱子时应避免这段管路。色谱柱的冲洗：先用一定比例的流动相冲洗，再用纯有机溶剂进行冲洗；不用时，一般保存在规定的有机溶剂中。C18柱（农药、兽药）：吸附中弱极性的物质；亲水性柱：三聚氨胺、PSP柱规
3、格：IOCmX2.43.0m,0.2-0.3mL/min；5cm1.8m0.2mL/min,其中柱压一般不超过350bar.一旦出现：柱压高：堵塞（系统+柱子）；柱压低：漏气（系统+柱子）1.3 六通阀定量环1.4 梯度洗脱注：从低比例有机溶剂的流动相开始，更改比例，但不要改变流速。阶段A：现将柱子里、管路中极性杂质先冲出，如水中的极性物质；阶段B:有机溶剂比例的提升阶段，分离被测液中的各组分，加强被分离组分与流动相的作用力；对于多组分的分离，更改梯度的斜率，但都是使有机溶剂的比例；阶段C稳定阶段：要有足够的时间使众多的弱极性杂质；阶段D：为下一针做着准备。2.质谱系统2.1 主要部位（接口，
4、其作用是离子化、气化和去溶剂）APCI:大气压化学离子化（甲烷气），间接电离的过程ESI:电喷雾离子源，既是接口装置，又是离子化装置离子源结构图2.2 真空系统机械泵（104Torr）,作用于离子源，去杂质;分子涡轮泵(IO-5Torr)在三重四级杆的中间加两个2.3 质量分析器ESI+加H离子化M+1+e.g.300+1解释了流动相加酸的原因-去H离子化M-1+e.g.300-1纯流动相四级杆的结构图注：LC-MS对手性物质较难分离，一般使用手性柱。质谱的完整结构图2.4离子扫描方式（I）SCan（全扫描模式）：需要设定一个扫描范围，如m/z:100500（2） SlM（离子选择性扫描模式）
5、：一个四级杆设定一个电压（即参数），如mz=300（3） Production：SIM+Scan（提高质谱仪电压）选择母离子筛选出子离了（IOo略大于母离子）（4） MRM（多反应监测）：SIM+SIM,只出现在多级质谱中:MS1二、仪器软件组成（具体操作过程见文件2）IMPa=IObar=I45psi;Ibar=I45psi请各位用户在各自的流动相瓶子做好标记，未作标记的瓶子将被收走（仪器自带的除外）文件请保存在D盘MaIter的D抵台文件夹中各自的目录下，否则将删除IBEHB室AgilentTechnologies第用软许使用过程中遇到故障或问题，欢迎拨打热线电话：135-9950-993
6、0.A请勿在仪器室内饮食！JK请仔细阅读各项提示！1 .数据采集软件2.定性分析软件3.定量分析软件三、仪器方法的建立1.一般性操作过程1.1 明确目标物，通过文献的搜集，整理出目标物的质谱参数（碰撞能、母离子、子离子及加速电压等）以及色谱系统中的梯度程序；1.2 确定色谱系统中的流动相和色谱柱等并准备好；13目标物的单标及混标的配置，配置完成以备用；1.4仪器方法的建立1.4.1 先进行目标物单标的质谱参数确定（无需连接色谱柱）1.4.1.1 打开数据采集软件：（DataAcquitationMassHunter,在线软件中正上方调出“HJJMethod”文件夹中的“OPTlMIZEm”方法
7、）1.4.1.2 在窗口下面的SamPleRUn中进行编辑:样品信息（Sample）Position（样品位置）；InjectionVolume（进样体积）；数据文件信息（Datafne）Name（文件名）和Path（数据文件的存储路径）1.4.1.3 母离子的确定打开MethodEditor对话框，点击QQQ选项设置各参数，扫描方式：SCan Adduced neU (10/100 evrM)9oowoo0 250 Ia)OaO)0010000 2S050SOOOOKO.505000ono90(0WOO02Q900010000 250ooo100)GOaooooo)c()CdmCa运行完毕后
8、，在DA位置点击ViewDate查看数据，进入QualitiveAnalysis离线软件界面。在QUaIitiVeAnalySiS离线软件中自动跳出TlC总离子流图如下图所示选择双向箭头图标，选取最高峰前后（任何位置出现的子离子均相同，只是响应强度不一）的一段范围，双击左键，在离子流图底下弹出丰度质荷比图。查看是否出现文献中所示母离子，若有进行下一步，若没有再查找其他文献。1.4.L4子离子的确定关闭QualitiveAnalysis离线软件，回到MethodEditor中的QQQ界面设置质谱参数：包括扫描方式（ProdUCtiOn）、加速加压母离子、扫描范围（根据相关文献确定范围，需注意，子
9、离子扫描范围应将母离子包括在内）和扫描时间及碰撞能的运行：Apply；Start卜G.QualitiveAnalysis（同1.4.1.3中的步骤）左键：选择谱图上的一段；双击，找子离子注：查看是否出现文献中所示子离子时，若有记录子离子与响应程度最高时的碰撞能。若无可自行选取核实的m/z作为子离子，根据响应程度选择合适的碰撞能，最终记录相关信息。确定子离子的依据：首先在各质谱图中找出响应较高（丰度比大）的离子，在对比不同碰撞能条件下的各离子的响应程度。1.4.2将质谱参数添加至方法中在MethOdEditOr中新建一方法，QQQ选项中设置以下质谱参数禽子源（Ionsource）:ESI：Tim
10、esegment（3） ScanSegments：注：调整Den使得Cyclesl,选择Unit模式，点击ApplySource:实际值与默认值要一致保存（路径）143色谱参数的确定（添加目标物的混标进行色谱参数的确定）梯度洗脱程序的设定3.4.3.1. 在MethodEditor中的BinaryPump选项中进行编辑（1）选择合适的流动相及流速（2）编辑洗脱程序在Timetable（xlOoeVentS）窗口梯度程序的设定（3）设置流动相参数FlOW（改流速）mL/minfAII1,2Solvent设置参数时要选定参数.IIB1,2PressureLimit：Min:0.00barMax:5
11、50bar保存，修改StoPtime:3Omin（与梯度洗脱程序时间一致）Postime:off3.4.3.2. MethodEditor中的HiPSamPle选项中进行进样针的吸取速度、注射速度、吸取深度与平衡时间等的编辑如：DrawFlow：200Lmin;其他不变C.在Properties中填写储存路径，保存方法1.4.4 运行方法Worklist：新建工作表SamplenameSamplepositionMethodDataFileS07Pl-F9LSY20150125PEST-Pl-F9-NoInjection.WASH-Script:.（添加一个事件，让仪器终止、稳定）保存1.4.
12、5 洗脱程序的优化使梯度程序时间尽量缩短，并使各物充分分离，并有足够强的响应程度1.C-MSMS的方法建立完成2.实例说明（以四种磺胺类样品为例进行本仪器的方法建立过程说明）以四种磺胺类样品的方法建立为例）2.1 材料的准备（磺胺类单标与混标的配制）（1）试剂准备：溶剂：甲醇（应与原样品一致）；单一标准品：磺胺二甲异恶噗（100OPPm）、磺胺嗑咤（100Oppm）.磺胺甲基嗑咤（100Oppni）和磺胺二甲异喀咤纳（100Oppm）;进样瓶（标签内容：e.g.名称:磺胺嗑咤；浓度：100Oppm;日期：2015.01.24）；（2）仪器工具：移液枪、2mL一次性注射器、0.22m滤膜、定量小
13、管（ImL）（3）配制：a.各吸取10L单标原样品至定量小管中，用甲醇定容至ImL,再过膜转移至进样小瓶中；b各吸取10L单标原样品至一定量小管中，用甲醇定容至ImL2.2 参数的搜集由相关文献查阅待测组分的质谱信息：代号名称母离子（mz）子离子（mz）碰撞能（eV）156.0IOS12磺胺喀咤251.0185.115S7磺胺甲基嗑咤265.1156.0172.01010124.120S13磺胺二甲异嗑陡279.0186.010156.010S15磺胺二甲异恶睫268.0113.0102.3 方法建立的过程：2.3.1 质谱参数的确定打开数据采集软件（DataAcquitationMassHu
14、nter,在线软件中正上方调出HJJMethod”文件夹中的“OPTIMIZEm”方法）A在窗口下面的SamPIeRUn中进行编辑（1）样品信息（SamPIe）Position:1F9；InjectionVolume:5pL；（2）数据文件信息（Dataflle）Name：HAEJYEOOd.Path:D：MassHunterDataLSY20150125pest-testB母离子的确定：在MethodEditor中进行编辑（1）在QQQ选项中设置参数SCantype:MS2Scan；扫描范围：100400mz;（根据相关文献查的母离子，保证在扫描范围内）扫描时间：500ms（保证CyCIes
15、21）目的是保证采集足够的点，在记录系统中形成离子流图;碰撞能：5eV（2）运行：Apply；start卜QualitiveAnalysis（根据查找的资料确定母离子）母离子：268（5）运行完毕后，在DA位置点击VieWDate查看数据，进入QUaIitiVeAnalySiS离线软件界面。在QUaIitiVeAnalySiS离线软件中自动跳出TlC总离子流图如下图所示选择双向箭头图标，选取最高峰前后(任何位置出现的子离子均相同，只是响应强度不一)的一段范围，双击左键，在离子流图底下弹出丰度-质荷比图。查看是否出现文献中所示母离子，若有进行下一步，若没有再查找其他文献。C子离子的确定关闭QUa
16、litiVeAnaIySiS离线软件，回到MethodEditor中的QQQ界面(1)设置质谱参数：SCantype:Production,加压：200,母离子：268(5),扫描范围：1OO35O(根据相关文献确定范围，需注意，子离子扫描范围应将母离子包括在内)，扫描时间：100ms,碰撞能：5,10,15,20(有必要时,可增加至25,30,35)运行：Apply；Start卜(3)QualitiveAnalysis：左键：选择谱图上的一段；双击，找子离子56(10),113(10)注：查看是否出现文献中所示子离子时，若有记录子离子与响应程度最高时的碰撞能。若无可自行选取核实的m/z作为子
17、离子，根据响应程度选择合适的碰撞能，最终记录相关信息。确定子离子的依据：首先在各质谱图中找出响应较高(丰度比大)的离子，在对比不同碰撞能条件下的各离子的响应程度。D.将质谱参数添加至方法中在MethodEditor中新建一方法在QQQ选项中设置质谱参数：离子源(Ionsource):ESI；Timesegment:Start timeScan TypeDiv ValveDelta Emv(+)OMRMtoMRM400ScanSegments：CompoundNamePrecursorIonMISResProductIonCollisionEnergyS07265Unit15615注：调整Dei
18、l使得Cyclesl,选择Unit模式，点击ApplySource:实际值与默认值要一致保存：路径：LSY-20150125pest-testE色谱参数的确定梯度洗脱程序的设定(1)在MethodEditor中的BinaryPump选项中进行编辑a.选择合适的流动相及流速b.编辑洗脱程序Timetable(xlOOevents)Time(min)A(%)B(%)FIow(mLmin)MaxPressure1.imit0.0090.0010.000.2505502.009010-10.008515-12.008515-16.007525-24.002080-26.002080-30.009010
19、-c.设置流动相参数FlOW（改流速）mL/minfAII1,2Solvent（设置参数时要选定参数）.IIB1,2MinOOObarPressureLimitMax:550bar保存，修改StoPtime:3Omin（与梯度洗脱程序时间一致）Postime:off（2）在MethodEditOr中的HiPSamPle选项中进行进样针的吸取速度、注射速度、吸取深度与平衡时间等的编辑如：DrawFlow：200Lmin:其他不变（3）在Properties中填写储存路径，保存方法F运行方法Worklist：新建工作表SamplenameSamplepositionMethodDataFileS0
20、7Pl-F9LSY20150125PEST-Pl-F9-NoInjection.WASH-Script:（添加一个事件，让仪器终止、稳定）保存F实际操作（洗脱程序的优化）a:45min,b:5.5-6.5min,c:7.89min，d:19-20min由于1018min无峰，则需进行优化，缩短梯度洗脱的时间优化1:Time(min)A(%)B(%)FIow(mLmin)MaxPressure1.imit0.0090100.255502.009010-10.008515-16.002080-18.002080-20.009010-Stoptime：20min优化2（46min出现两个峰比较相近，
21、因此进行优化）Time(min)A(%)B(%)Flow(mLmin)MaxPressure1.imit0.0090100.255502.009010-11.008515-13.002080-15.002080-17.009010-Stoptime：17.00min优化后出峰时间:a:4-5.6min，b:5.76.5min，c:7.89min，d:14-14.7min优化3（进一步缩短c.d两个峰的间距）Time(min)A(%)B(%)Flow(mLmin)MaxPressure1.imit0.0090100.255502.009010-10.008515-11.002080-13.002
22、080-15.009010-Stoptime：15min优化后出峰时间:a:45.5min,b:5.7-6.5min,c:7.8-9min,d:12.813.2min测定结果：b(sl2)c(s07)a(sl3)d(sl5)注：梯度洗脱的目的是使各物质尽可能分离，分离时间有足够家具，且保证峰型尚佳LC-MSMS的方法建立完成。四、LCMSMS的关机顺序A(A1-1O3)1.在WorkHSt界面(加图)：(1)关闭所有程序(进样针、泵等)(2)在QQQ空白处右击：ventok2 .在Methodeditor界面：等待TUbOlspeed和Tubo2speed的值均降至10%以下3 .关闭色谱系统和质谱系统的开关4 .关闭记录系统(即电脑中打开的软件)5 .关闭主机开关B(A1-102)1 .关闭氮气发生器前阀门开关和氮气输出前的阀门开关以及氮气瓶总阀门：2 .关闭氮气发生器控制面板上的，”按钮3 .关闭电压控制器开关；4 .关闭氮气发生器后面的开关；5 .关闭总阀门A(A1-103)用抽屉中“一白一黑”的钥匙打开电路控制箱，关闭氮气发生器和氮气输入控制电路的阀门五.注意事项(1)相关参数的修改，如设定梯度洗脱程序时，应修改“Stoptime”；(2)在“BinaryPump”设置流动相参数时要选中；(3)设定梯度洗脱程序时，从低有机溶剂比例开始，梯度增加应缓慢进行
