《脱氢酶dehydrogenase,DHA试剂盒说明书.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《脱氢酶dehydrogenase,DHA试剂盒说明书.docx(2页珍藏版)》请在课桌文档上搜索。
1、脱氢酶(dehydrogenase,DHA)试剂盒说明书微量法100管用6样注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定.测定意义:脱氢函(dehydrOgenaSe,DHA)是一类催化物质氧化还原反应的酶,催化底物通过细胞色素系统被氧化,释放的能量供机体使用,是生物体取得能量的一种方式。测定原理:在细胞呼吸过程中,氢受体2,3,5-氯化三苯基四氮哩(2,3,5-TriphenylTetrazoliumChloride,TTO在脱氢酶作用卜接受氢以后,被还原为三苯基甲猫(TriPhenylFOrmaZOne,TF),TF呈现红色,于485nm测定其吸光值,即得脱氢酶活性。自备实验仪器
2、及用品:筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿用6孔板、冰、蒸储水、甲醇(不允许快递,请用户自备)。试剂的组成和配制:提取液:液体100mLXl瓶,4匕保存试剂一:粉剂1瓶,使用前加10mL试剂二溶解,4C避光保存(尽量现配现用)。试剂二:液体20mll瓶,4保存。试剂三:甲醇,自备。样品处理:1 .细菌、真菌:按照细胞数量(IO4个):提取液体积(mL)为50010:1的比例(建议500万细胞加入ImL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min):然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。2 .组织
3、:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:510的比例(建议称取约Slg组织,加入Iml提取液)进行冰浴匀浆,然后8000g,4*C,离心20min.3 .液体:直接检测。测定步骤和操作表:空白管测定管样品(UL)100蒸馀水(UL)100试剂一(uD100试剂二(D100充分混匀,37C培养24h试剂三(L)900900振荡lh,8000g.25,离心5min,取200L上清于微量石英比色皿出6孔板,测定A485,ZXA=A测定-A空白管。空白管只要做一管。脱氢酶活力计算:a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线:y=0.0422x-0.0312;R2=0.9988:X为标准品浓度
4、(gmL),y为吸光值。1.按照蛋白浓度计算酶活单位定义:在37时,每mg蛋白样品每min催化产生IHgTF为一个酶活性单位。DHA(gminmgprot)=(A+0.0312)0.0422V反总(CPrXV样)T=0.181x(A+0.0312)Cpr2.按照样本质量计算酶活单位定义:在37时,每克样品每min催化产生IUgTF为一个酶活性单位。DHA(gmin/g鲜重)=(A+0.0312)0.0422xV反总(WXV样V样总)T=0.181(A+0.0312)W3.按液体体积计算酶活单位定义:在37时,每mL样本每min催化产生IUgTF为一个酶活性单位。DHA(gminmL)=(A+0
5、.0312)0.0422xV反总V样T=0.181X(A+O.O312)V反总:反应总体积,1.1mL:V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL:T:培养时间,Id=I44Omin:W:样品质量,g;Cpr:蛋白浓度,mg/mLob.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线:y=0.0211x-0.0312;R2=0.9988:X为标准品浓度(gmL),y为吸光值。1.按照蛋白浓度计算酶活单位定义:在37时,每mg蛋白样品每min催化产生IUgTF为一个酶活性单位。DHA(gmin/mgprot)=(A+0.0312)+0.021IXV反总(CPrXV样)T=0.362(A+0.0312)Cpr2
6、.按照样本质量计算酶活单位定义:在37时,每克样品每min催化产生1gTF为一个酶活性单位。DHA(gmin/g鲜重)=(A+0.0312)+0.021IXV反总(WXV样V样总)T=0.362(A+0.0312)W3.按液体体积计算酶活单位定义:在37时,每mL样本每min催化产生IUgTF为一个醉活性单位。DHA(gminmL)=(A+0.0312)0.021:LXV反总V样T=0.362(A+0.0312)V反总:反应总体积,1.1mL:V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL:T:培养时间,Id=I44Omin:W:样品质量,g;Cpr:蛋白浓度,mgmL注意事项:配制好的试剂一避光保存于4,最好在一周内使用,若出现红色,则不能使用。