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1、附件丽程肝炎焉毒安空室桧部）技术胞冕（2023年打版）中国疾病预防控制中心二。二三年十月录前言1第一章丙型肝炎病毒感染41.HCV病毒学特点42.HCV传播途径和致病机制73.HCV感染分期和临床表现84.HCV感染检测标志物95.HCV感染的治疗11参考文献12第二章样品的采集、保存和运输161.样品采集162.样品的接收、保存和运输17参考文献19第三章UCV抗体检测201.HCV抗体检测方法202.IICV抗体检测方法的选择和应用24参考文献25第四章HCV核酸检测271.IICV核酸检测方法272.HCV核酸检测方法的选择和应用28参考文献31第五章IICV抗原检测321.HCV抗原检
2、测方法322.HCV抗原检测方法的选择和应用34参考文献35第六章HCY感染检测流程371.个体诊断相关检测流程及结果报告372.血液筛查相关检测流程及结果报告413.流行病学调查相关检测流程及结果报告44参考文献45第七章HCV基因序列分析471.HCV基因分型检测方法和应用472.HCV耐药检测方法和应用503.HCV分子溯源检测方法和应用52参考文献54第八章HCV细胞培养和中和抗体检测581.IICV细胞培养方法582.HCV细胞培养方法在HCV中和抗体检测中的应用.61参考文献61第九章HCV检测实验室的室内质量控制641.质控品642.质控品的检测频次和位置653.质控规则和质控图
3、664.失控原因分析和处理68参考文献70第十章HCV检测实验室生物安全和职业暴露711.HCV检测实验室生物安全注意事项712.HCV职业暴露及处理措施73参考文献76前丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种主要经血液传播的疾病，HCV慢性感染可导致肝脏慢性炎症和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命产生危害。据世界卫生组织统计，截至2019年全球约有5800万人患有慢性丙型肝炎，2019年丙型肝炎新发感染约150万人，约有29万人死于HCV感染，其中大部分由肝硬化或肝细胞癌引起。2019年仅有21%的慢性丙型肝炎患者得到诊断。世界卫生组织在2016年发布的20
4、16-2021年全球卫生部门病毒性肝炎战略中提出到2030年消除作为主要公共卫生危害的病毒性肝炎的目标,其中一个指标是到2030年90%以上的HCV感染者得到诊断。我国在2021年发布的消除丙型肝炎公共卫生危害行动工作方案(2021-2030年)中要求加大丙型肝炎检测力度，提高检测发现率，实施医疗机构和重点人群“应检尽检”、大众人群愿检尽检”策略、抗体阳性者核酸检测全覆盖”策略。HCV感染的实验室检测为丙型肝炎患者的检测发现和诊断提供关键依据，并在评估抗病毒治疗效果以及鉴定病毒亚型和耐药性等工作中具有不可或缺的重要作用。自2011年发布丙型肝炎病毒实验室检测技术规范(试行)以来，HCV感染检测
5、技术不断发展，检测试剂性能显著提高，新的检测服务策略不断出现并逐步推广应用。同时，丙型肝炎防治工作的推进对HCV检测提出了新的要求。为实现2030年消除病毒性肝炎的目标,进一步加强我国HCV感染检测的规范性，提高实验室检测质量，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心组织专家对丙型肝炎病毒实验室检测技术规范进行了修订。近年来由于直接抗病毒药物（DAAs）可使95%以上的丙型肝炎患者得到治愈，世界卫生组织大力倡导简化HCV感染检测和诊断流程，缩短检测和诊断时间，以使丙型肝炎患者尽快得到治疗。本次修订工作参考了世界卫生组织以及国内外对HCV感染检测的最新指南和技术指导文件，充分考虑了HCV感染检
6、测技术和检测策略的进步，广泛征集了丙型肝炎检测和防治等领域专家的修订建议，并切实结合了我国丙型肝炎防治工作的需求。修订后的丙型肝炎病毒实验室检测技术规范（2023版）（以下简称规范）共分十章，包括：丙型肝炎病毒感染，样品的采集、保存和运输，HCV抗体检测，HCV核酸检测，HCV抗原检测，HCV感染检测流程，HCV基因序列分析，HCV细胞培养和中和抗体检测，HCV检测实验室的室内质量控制及HCV检测实验室生物安全和职业暴露。新版规范将对进一步规范和提升我国HCV检测工作质量起到重要推动作用。本规范参加编写和审核的单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制
7、所、中国食品药品检定研究院、军事科学院军事医学研究院、北京大学医学部、北京大学人民医院、北京地坛医院、北京友谊医院、上海市疾病预防控制中心、中国科学院上海巴斯德研究所、北京清华长庚医院、北京佑安医院、北京市红十字血液中心、中国医学科学院病原生物学研究所、中国医科大学第一临床学院。本规范编写学术顾问：庄辉、蒋岩本规范编写主持人：金聪本规范编写人员：金聪、邢文革、沈立萍、饶慧瑛、贾继东、鲁凤民、王雅杰、周诚、钟劲、钟平、邱茂锋、李敬云本规范审核人员：魏来、韩孟杰、刘中夫、葛利荣、吴昊、葛红卫、何玉先、姜拥军、李健、马丽英本规范自发布之日起施行，同时终止丙型肝炎病毒实验室检测技术规范（2011年版）
8、本规范适用于全国所有的丙型肝炎病毒检测实验室。本规范解释权属于中国疾病预防控制中心。第一章而租股空痣毒劣丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)于1989年被正式命名，之前曾称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒，1991年被归为黄病毒科(FIaViViridae)。丙型肝炎是由HCV感染引起的一种肝脏炎症，其严重程度从轻微病症到终身严重疾病，包括肝硬化和肝癌。目前尚无针对丙型肝炎的有效疫苗，HCV感染的预防主要依赖于在医疗卫生机构以及在高危人群中减少暴露风险。本章主要介绍了HCV的病毒学特点、传播途径和致病机制、感染分期和临床表现、感染检测标志物以及治疗方案。1.HCV病毒学特点1
9、.1HCV的病毒形态、基因组结构及复制周期HCV属于黄病毒科(FIaViViridae)的丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)。HCV是有包膜的单股正链RNA病毒，病毒体为球状颗粒，直径约为4060nm,去除包膜后暴露其中的核衣壳，直径约为33nHCV基因组长度约为9.6kb,编码单一的开放读码框(OPenreadingframe,ORF)。HCV的ORF两侧分别为5非编码区和3非编码区，HCV前体蛋白翻译起始于5非编码区的内部核糖体位点(internalribosomeentrysite,IRES)o翻译启动后首先产生一个约3000个氨基酸的HCV前体蛋白。前体蛋白可被宿主蛋白酶加工成为
10、组成病毒颗粒的三个结构蛋白Core、El和E2,，IRES5NTR同时被HCV自身编码的蛋白酶和宿主蛋白酶共同加工，成为七个非结构蛋白P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B（图1）。前体蛋白（9.6kb）n3NTR结构蛋白非结构蛋白Elp7 NS2 NS3 4A 4B NS5ANS5B图1HCV基因组结构C：核衣壳；E1/E2：包膜糖蛋白；P7：离子通道；NS2：自身蛋白酶；NS3：丝氨酸蛋白酶（N端1/3）、解旋酶（C端2/3）；NS4A：丝氨酸蛋白酶辅助因子；NS4B：膜整合蛋白；NS5A：调节病毒复制和组装的因子；NS5B：RNA依赖的RNA聚合酶HCV感染宿主肝细
11、胞后经过病毒颗粒入胞、基因组翻译、RNA复制以及成熟病毒颗粒的组装和释放完成整个复制周期，具体为:HCV附着于肝细胞表面并与相关受体结合，通过内吞作用进入细胞并被转运到胞内体；胞内体的低PH环境促使HCV包膜与胞内体膜融合，触发了HCVRNA的脱壳和释放；HCVRNA释放后由基因组中的IRES开始翻译生成前体蛋白，前体蛋白经蛋白酶切割为成熟的结构蛋白和非结构蛋白并与内质网膜紧密结合，其中NS3/4A、NS4B、NS5A和NS5B与病毒RNA及宿主细胞中参与复制的蛋白组装成复制复合体，在NS5B聚合酶的催化下，以HCV正链RNA为模板启动负链RNA的合成，再以负链RNA为模板合成大量的正链RNA
12、；正链RNA和核心蛋白相接触并被包裹为核心颗粒，从内质网以出芽方式形成病毒颗粒，病毒颗粒经高尔基体由分泌途径出胞（图2）。HCV复制效率很高，每日复制的病毒颗粒可高达102个拷贝。1.2HCV的分型依据HCV基因组序列的同源性和进化距离大小，HCV分为基因型和亚型，按照国际惯例以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写英文字母表示基因亚型，如la、2b、3c等。HCV主要分为6个基因型，HCV基因型和亚型存在明显的地域分布差异。基因1-3型最普遍，呈全球性分布，其中Ia和Ib占所有HCV感染的60%以上。1型和2型主要流行于欧洲、美洲和亚洲；3型主要流行于南亚地区；4型主要流行于中非和中东地区；5型
13、主要流行于南非；6型主要流行于东南亚地区。我国流行的HCV以Ib和2a基因型较为常见，其中以Ib型为主，约占60%以上；其次为2型、3型和6型，4型和5型非常少见。2.HCV传播途径和致病机制HCV的传播途径主要有三种，即血液传播，性接触传播和母婴垂直传播，血液传播是最主要的传播途径。我国自1993年对献血员筛查HCV抗体，2015年开始对HCV抗体阴性的献血员实行HCVRNA筛查，目前通过输血或血液制品传播的现象较为少见。近年来我国HCV最主要的传播方式包括：使用被HCV污染的医疗器械进行侵袭性操作，以共享注射器具方式注射毒品等。HCV不会通过母乳、食品或水源传播，也不会通过与感染者拥抱、握
14、手、共用餐具等方式传播。研究认为HCV感染的致病机制主要分为两个方面，一是细胞免疫介导的肝脏免疫损伤，即HCV感染肝细胞后诱发人体免疫反应，淋巴细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞攻击肝细胞造成肝脏病理损害；二是HCV感染的直接致病作用，HCV在肝细胞内复制干扰了肝细胞蛋白合成，引起肝细胞结构和功能改变，造成肝细胞变性和坏死，直接损害肝脏。3.HCV感染分期和临床表现HCV可引起急性或慢性感染。急性HCV感染者通常没有症状或症状轻微，约有30%(15-45%)的感染者不经任何治疗即可在感染6个月之内(其中多数在出现症状后的3个月内)自行清除病毒，这一比例因地区和人群而异。其余70%(55%-85%)的
15、急性HCV感染者会进展到慢性HCV感染，即感染持续6个月以上。如果不经有效治疗，部分慢性丙型肝炎患者可进展为肝硬化和肝细胞肝癌。3.1急性丙型肝炎约80%的急性HCV感染者在临床上通常表现为症状轻微或没有症状的亚临床感染。约20%-25%的患者表现为急性肝炎，通常为无黄疸型(约占75%),仅有不到1%的患者可发生急性肝衰竭。部分急性HCV感染者可能出现乏力、食欲减退、恶心、腹胀和右季肋部不适或疼痛、尿色深、粪便苍白、关节疼痛，少数可伴有低热和黄疸等症状。3.2慢性丙型肝炎慢性丙型肝炎患者大多数无症状或仅有轻微症状，最常见的表现是乏力。部分患者有肝病面容、黄疸、肝掌、蜘蛛痣、以及轻度肝脾肿大。大
16、多数慢性丙型肝炎患者的血清转氨酶(ALT)水平轻度升高，大约1/3的患者ALT水平正常。3.3丙型肝炎肝硬化慢性丙型肝炎患者中约5-15%可在20年内进展为肝硬化。代偿期肝硬化的定义是有肝硬化的病理或影像、内镜、生化及临床证据，但没有发生腹水、食管胃静脉曲张破裂出血或肝性脑病等严重并发症者。丙型肝炎肝硬化患者大多数无明显症状，或仅有乏力、腹胀、食欲降低等非特异症状；部分患者可见肝病面容、黄疸、肝掌、蜘蛛痣、腹壁静脉曲张。实验室检查可见不同程度血清氨基转移酶升高、胆红素升高、白蛋白降低和血小板减少。内镜检查可见食管胃静脉曲张。影像学检查可见肝脏缩小、表面不光滑、裂隙增宽，肝实质呈颗粒样或结节样，
17、门静脉增宽、脾脏增大、门体侧枝循环形成；肝脏弹性测定显示硬度增加。代偿期肝硬化每年有3-4%进展为失代偿期肝硬化，其定义是肝硬化患者发生腹水、食管胃静脉曲张破裂出血、肝性脑病等严重并发症。3.4HCV相关肝细胞肝癌绝大多数丙型肝炎所致的肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）发生在肝硬化基础之上。在丙型肝炎肝硬化患者中，每年约有2%-4%可进展为HCC。其诊断主要靠影像学检查,甲胎蛋白及其他肿瘤标志物可作为辅助指标。4.HCV感染检测标志物HCV暴露后首先引起急性感染，即在暴露于HCV后6个月内出现HCV感染的标志物（先出现HCVRNA和HCV核心抗原p22,随后出
18、现HCV抗体）。在无抗病毒治疗的情况下，一部分HCV感染者通常在感染后6个月内自发清除HCV感染（图3A）,其余感染者因在6个月内未能清除病毒感染，转为慢性HCV感染，即慢性丙型肝炎（图3B）。感染过HCV后，HCV抗体可持续存在,但其并非中和抗体，不能提供持久保护。无论感染者是自发清除病毒，还是在抗病毒治疗后治愈，可再次被同种基因型或不同基因型的HCV感染。在HCV暴露1-2周后可检测到HCVRNA,HCVRNA达到高峰（I（Tlo7u/mL）的时间略早于血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平达到峰值和临床症状出现。以游离形式存在的HCV核心抗原P22与RNA水平呈正相关，使用灵敏的试剂也可较早
19、被检测到。之后的6-10周可能仍无HCV抗体应答产生，这个时期被称作血清学检测窗口期”，在此期间抗体无法被检测到。HCV感染检测标志物的动态变化如图3所示。近年来的一些报告提示存在隐匿性HCV感染，即在没有任何血清学标记物的情况下检测到HCVRNAo隐匿性HCV感染可能是由于个体具有潜在的免疫抑制，例如艾滋病毒感染的人群。（八）自限性HCV感染;(B)慢性HCV感染5.HCV感染的治疗聚乙二醇干扰素-(Peg-IFN-)联合利巴韦林方案(PR)曾是治疗慢性丙型肝炎的标准抗病毒方案。其1年疗程的总体持续病毒学应答率(sustainedvirologicresponse,SVR)为60%左右，对H
20、CV基因型1、4型疗效较差(SVR为44%53%),对2、3型疗效较好(73%)。但是其副作用较大，而且不适用于失代偿期肝硬化患者，现临床上已经不再应用。目前临床抗病毒治疗方案应用直接抗病毒药物(directactingantiviralagents,DAAS)有效阻断HCV在肝内的复制。DAAs是一类小分子化合物，通过抑制HCV生命周期中特异性的蛋白或酶,例如HCV非结构蛋白NS3/4A、NS5A和NS5B等，发挥抗病毒作用。DAAS主要包括NS3/4A蛋白酶抑制剂、NS5A蛋白抑制剂和NS5B聚合酶抑制剂等。NS3/4A蛋白酶抑制剂类包括有：格拉瑞韦、格卡瑞韦、达诺瑞韦、伏西瑞韦等，NS5
21、A蛋白抑制剂包括有：达拉他韦、维帕他韦、可洛派韦、哌仑他韦、艾尔巴韦、来迪派韦、依米他韦、拉维达韦等，NS5B聚合酶抑制剂包括有索磷布韦等。世界卫生组织指南推荐的DAAS方案为：索磷布韦/维帕他韦、格卡瑞韦/哌仑他韦、索磷布韦联合达拉他韦，均是泛基因型方案。我国丙型肝炎防治指南（2022版）首先推荐泛基因型方案。根据药物的疗效、安全性以及可及性，我国推荐的泛基因型DAAS方案为：索磷布韦/维帕他韦、可洛派韦联合索磷布韦，泛基因型方案针对HCV各型均有效（不论是否有肝硬化，包括干扰素初治和经治）。针对HCV基因Ib型的治疗，我国推荐的方案包括：艾尔巴韦/格拉瑞韦、来迪派韦/索磷布韦、依米他韦联合
22、索磷布韦、达诺瑞韦/利托那韦联合拉维达韦及利巴韦林。95%以上的慢性丙型肝炎患者经过12周DAAs治疗后可获得SVR,获得SVR后可改善肝功能、逆转肝纤维化、降低肝硬化失代偿以及HCC的发生率，改善预后以及提高生活质量。参考文献1.StevenRoger,AlexandraDucancelle,H616neLeGuillou-Guillemette,etal.HCVvirologyanddiagnosis.Clinicsandresearchinhepatologyandgastroenterology2021；45（3）：101626.2.PeninF,DubuissonJ,ReyFA,et
23、al.StructuralbiologyofhepatitisCvirus.Hepatology,2004,39(1)：5-19Moradpour,D,Penin,F,RiceMF.ReplicationofHepatitisCvirus.NatRevMicrobiol.2007；5(6)：453-63.3.Moradpour1D,Penin,F,RiceMF.ReplicationofHepatitisCvirus.NatRevMicrobiol.2007；5(6)：453-63.4.GerresheimGK1RoebE,MichelM,etal.HepatitisCVirusDownreg
24、ulatesCoreSubunitsof0xidtivePhosphorylation,ReminiscentoftheWarburgEffectinCancerCells.Cells.2019Nov8；8(11)：1410.5.BorgiaSM,HedskogC,ParhyB,etal.IdentificationofanovelhepatitisCvirusgenotypefromPunjab,India：expandingclassificationofhepatitisCvirusinto8genotypes.J.Infect.Dis.,2018,218(11)：1722-17296.
25、ShahR,AhovegbeL,NiebelM,etal.Non-epidemicHCVgenotypesinlow-andmiddle-incomecountriesandtheriskofresistancetocurrentdirect-actingantiviralregimensJ.Journalofhepatology,2021,75(2)：46273.7.LuL,NakanoT,HeY,etal.HepatitisCvirusgenotypedistributioninChina：predominanceofcloselyrelatedsubtypeIbisolatesandex
26、istenceofnewgenotype6variantsJ.Journalofmedicalvirology,2005,75(4)：538-49.8.WHO.HepatitisCEBOL.2023-06-7https：/www.who.int/news-room/fact-sheetsdetailhepatitisc.9.WHO.GuidelinesonHepatitisBandCTestingM.Geneva：WorldHealthOrganization,2017.10.ASLDIDSAHCVGuidancePanel.HepatitisCGuidance2018Update：AASLD
27、-IDSARecommendationsforTesting,Managing,andTreatingHepatitisCVirusInfection.ClinInfectDis.2018；6710)：1477-1492.11.KanwalF,SingalAG.SurveillanceforHepatocellularCarcinoma：CurrentBestPracticeandFutureDirection.Gastroenterology.2019；157(1)：54-64.12.LuciaParlati,ClemenceHollande,StanislasPol.Treatmentof
28、hepatitisCvirusinfection.Clinicsandresearchinhepatologyandgastroenterology2021Jul；45(4)：101578.13.YeeBE,NguyenNH,ZhangB,etal.SustainedvirologicalresponseanditstreatmentpredictorsinhepatitisCvirusgenotype4comparedtogenotypes1,2,and3：ametaanalysis.BMJOpenGastroenterol.2015；2(l)：e000049.14.RockeyDC,Fri
29、edmanSL.FibrosisRegressionAfterEradicationofHepatitisCVirus：FromBenchtoBedside.Gastroenterology.2021；160(5)：15021520.15.CalvarusoV,CabibboG,CacciolaI,etal.IncidenceofHepatocellularCarcinomainPatientsWithHCV-AssociatedCirrhosisTreatedWithDirect-ActingAntiviralAgents.Gastroenterology.2018；155(2)：41142
30、1,16.EuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver.EASLrecommendationsontreatmentofhepatitisC:finalupdateoftheseries.JHepatol2020；73(5)：1170-218.17.中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.丙型肝炎防治指南(2022年版)JL中华肝脏病杂志，2022,30(12)：1332-1348.第二幸择品的家经、仔存徇也输本章介绍了用于HCV感染检测的全血、血清、血浆、干血斑等样品的采集和处理方法，适用于HCV抗体、抗原、核酸和基因型检测。样品采集按照试剂盒说明书
31、及临床样品采集标准操作规程进行。样品采集后的保存、运输条件应参照不同检测系统对样品保存、运输的要求执行。1,样品采集1.1采样前准备根据检测项目的具体要求，在样品采集前应制定详细的样本采集方案，比如确定采集样品的种类，保存及运输的时限和方法，确认样品储存条件。采样前应检查所需物品，比如采血用具、皮肤消毒用品、采血管和废弃物容器等是否已备齐，是否在有效期内。尤其关注受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间及唯一编码，保证检验样品的记录可追溯。1.2血液样品采集采集血液样品宜选择适宜的室内（外）空间，患者取卧位或坐位，按照临床采血技术要求操作。静脉血：静脉血采集按照卫生行业标准，
32、消毒局部皮肤，用加有抗凝剂的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀10-15次,以防止血液凝固。末梢全血：将采血部位局部消毒后，采用无菌采血针穿刺取血，成人采血部位以左手无名指为宜，1岁及以下婴幼儿通常自拇指或足跟两侧采血，应该尽量避免从耳垂处取血。干血斑：穿刺采集的末梢血或抽取的静脉血约50-100l滴加在滤纸上，注意不要让血液滴落在其它物体表面造成污染。置50。C烘箱中干燥15分钟或在常温放置5小时以上，待血样干燥后即制成干血斑，包装好后送检。血清：将采集的静脉血在室温自然放置1-2小时，待血液凝固和血块收缩后离心，即可得到血清。血浆：将
33、采集的抗凝静脉血进行离心即可分离得到血浆。用于核酸RNA检测的血浆样品，要求使用不含抗凝剂或含EDTA或ACD抗凝剂的无菌真空采血管及配套采血器静脉采血。如进行PCR检测，不能使用含肝素抗凝剂的采血管，避免PCR反应受到抑制。2.样品的接收、保存和运输2.1样品接收2.1.1样品接收前应检查送检样品的完整性，运送是否符合要求，查看样品送检登记表填写情况，核对样品与化验单是否符合，检查样品管有无破损和溢漏、干血斑样品包装是否完整等情况。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和容器消毒。2.1.2查看样品的质量，如血液样品有无严重溶血、微生物污染、乳糜血、黄疸等，记录并明确样品状况对相应的检
34、测是否造成影响。对于不合格样品，实验室需通知临床重新采集并进行记录。2.1.3及时登记有关参数，包括样品试管上的相关资料如受检者代号、试管编号、性别、年龄以及送检单位和送检日期等。2.2样品保存静脉血液标本采集后应及时送检，在4-6小时内完成送检及离心分离血清/血浆。用于HCVRNA检测的样品建议在4小时内送至实验室。用于抗体或抗原检测的血清或血浆样品如在1周内进行检测，可存放于2-8cC。用于HCVRNA检测的血清或血浆样品如在72小时内进行检测，可存放于2-8。（2。所有样品长期保存超过2周时，应置于-80。C保存。2.3样品运输2.3.1全血样品在短时间可送达时，如10分钟左右，可在室温
35、下运送；如需长途运输或气温较高时，需在2。C-10。C的冷藏条件下运送，固定冰点材料应放置在血液的最上层，并且不得与血液直接接触。运输全血时，不得使用-65。C或以下温度条件下制备的固定冰点材料或干冰。2.3.2冻存的血清或血浆样品应使用-18。C或以下温度条件下制备的固定冰点材料或干冰在冰冻条件下运送。2.3.3样品运送必须有记录并符合生物安全要求。参考文献1.中华人民共和国国家卫生健康委员会.静脉血液标本采集指南：WS/T661-2020S.北京：中华人民共和国国家卫生健康委员会，2020.2.国家标准化管理委员会.人类血液样本采集与处理：GB/T38576-2020S.北京：国家标准化管
36、理委员会，2020.3.WHO.GuidelinesonHepatitisBandCTestingM.Geneva：WorldHealthOrganization,2017.4.中国合格评定国家认可委员会.医学实验室质量和能力认可准则的应用要求：CNAS-CL02-A001S.北京：中国合格评定国家认可委员会，2021.第三章HC/抗体桧部)本章介绍了HCV抗体的检测方法、检测方法的选择和应用等。1.HCV抗体检测方法HCV抗体检测方法主要分为酶联免疫吸附试验、化学发光免疫分析试验、快速检测试验、和免疫印迹试验等。1.1酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentass
37、aytELIS)间接法酶联免疫吸附试验检测HCV抗体的基本原理是以HCV抗原包被固相载体，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与被检样品中的HCV抗体反应，以邻苯二胺(OPD)或3,3,5,5,四甲基联苯胺(TMB)等底物显色后，利用酶标仪等仪器进行定性结果判断。其主要反应过程如下：加入经样品稀释液稀释的被检样品，样品中的HCV抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物；其他免疫球蛋白及样品中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去；加酶标抗人IgG与固相复合物中的抗体结合；洗涤后，固相载体上的酶量相应显示特异性抗体的量；加底物显色后加入终止液，利用酶标仪等仪器分析结果。双抗原夹心法酶联免疫吸
38、附试验也应用于HCV抗体的检测，使用HCV抗原包被固相载体，加入生物素化HCV抗原与被检样品中HCV抗体的混合物进行反应，形成“包被抗原-抗体-生物素抗原”结构的免疫复合物，并结合在固相载体上。通过洗涤去除未结合的生物素抗原和抗体，再加入辣根过氧化物酶标记的亲和素,形成包被抗原-抗体-生物素抗原-酶标记亲和素结构的免疫复合物，加底物显色后加入终止液，利用酶标仪等仪器分析结果。1.2化学发光免疫分析试验(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)化学发光免疫分析试验是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体等的检测分析技术。
39、HCV抗体的化学发光免疫分析试验与酶联免疫吸附试验原理相同，采用间接法或双抗原夹心法原理检测HCV抗体，通过自动化程度较高的化学发光仪分析结果。化学发光免疫分析试验根据不同的标记方法分为两种：1.2.1化学发光标记免疫分析试验：化学发光标记免疫分析试验又称化学发光免疫分析试验(CLIA),是一种用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有。丫唉.酯类化合物一Hcridiniumester(AE),是有效的发光标记物，通过启动发光试剂而发光，强烈的直接发光可在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光JY唳酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂。检测小分子抗原
40、采用竞争法，检测大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。1.2.2化学发光酶免疫分析试验：从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析试验（chemiluminescentenzymeimmunoassay,CLEIA）应属于酶免疫分析，只是反应的底物是发光剂，操作步骤与酶联免疫吸附试验完全相同。以酶标记抗原或抗体进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物。该方法又分为如下三类：1.2.2.1HRP标记的CLEIA：常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺，是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧
41、（过氧化阴离子（T,单线态氧02,羟自由基OH-,过氧化氢上02）存在下生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nrn。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体，但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH此。2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。1.2.2.2增强发光酶免疫分析（enhancedluminescenceenzymeimmunoassay,ELEIA）:在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性
42、。1.2.2.3ALP标记的CLElA：所用底物为环1,22二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团，在酶及启动发光试剂作用下引起化学发光。1.3快速检测试验(rapiddiagnostictests,RDTs)快速检测试验是一种简便的检测方法，可在30分钟内通过人工肉眼判读得到定性结果。快速检测试验主要使用免疫胶体金技术，主要分为以下两类：1.3.1免疫渗滤试验(immunofiItrationtest)：以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原以点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。有
43、效试验的质控点必须显色。1.3.2免疫层析试验(Immunochromatographictest):以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原以线状固定在膜上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控线必须显色。1.4免疫印迹试验(westernblot,WB)免疫印迹试验一般将HCV的多种抗原成分喷涂在硝酸纤维薄膜条上，并设置了两种不同浓度的人IgG对照带和一条hSOD对照带，用于内部对照和结果判断。其诊断HCV感染的敏感性高、特异性强，可检测针对HCV不同抗原的抗体，且不需要特殊的仪器设备。但这类检测方法比其他血清学检测方法的成本更高，而且有较高比例的不确定结果
44、。1.5HCV抗体抗原联合检测试验近年来一类可以同时检测HCV抗体和核心抗原的HCV抗体抗原联合检测试验(包括酶免法及发光法)在国内外应用，我国也有产品获得了注册。HCV抗原和HCV抗体联检试验的原理是基于双抗体夹心法检测HCV核心抗原，或基于双抗原夹心法检测HCV抗体。2.HCV抗体检测方法的选择和应用HCV抗体检测广泛应用于个体的筛查检测和临床诊断、献血员筛查和原料血浆筛查、流行病学监测等。酶联免疫吸附试验、化学发光试验和快速试验多用于HCV感染的血清学筛查检测，免疫印迹试验可用于确认血清学抗体筛查检测试验的阳性结果。基于抗体的检测不能用于诊断HCV现症感染。在具备实验室检测条件或每天承担
45、大量检测的情况下，建议采用基于实验室的检测方法，比如酶联免疫吸附试验和化学发光免疫分析试验，进行筛查检测，具有更高的成本效益。快速检测试剂的操作简单、反应时间快（30分钟之内），可在检测当天获得结果。大多数快速检测试剂使用指尖血，可由经过培训的基层卫生工作人员操作。因此在不具备实验室检测条件的资源有限环境中或者外展检测中建议使用快速检测试剂，可以极大促进HCV检测的可及性，加强转介和减少感染者随访过程中的流失。与基于实验室的筛查检测试剂相比，HCV抗体的快速检测试剂具有可接受的敏感性和特异性。但快速检测试剂的局限性是一般不适用于检测大量血液样品，结果读取依赖于主观判断，原始检测结果不能永久保存
46、等。世界卫生组织在2021年提出HCV筛查检测可以由个体使用HCV抗体快速检测试剂进行自我检测。自我检测是个体为了解感染状况，在私密环境下自己收集样品进行测试并读取结果的过程。目前，丙型肝炎自我检测的应用经验还非常有限，但这是未来扩大检测的一种潜在的重要方法。HCV抗体抗原联合检测主要用于HCV感染的筛查检测，因为HCV抗原可以比HCV抗体更早被检测到，加入抗原可以提高早期感染检测的敏感性，并缩短抗体检测试剂的检测窗口期，但不能区分既往感染和现症感染，也不能区分急性和慢性丙型肝炎病毒感染。需要注意的是，仅进行抗体检测，可能出现假阳性或假阴性的结果。在一些自身免疫性疾病患者中，可出现HCV抗体检
47、测结果的假阳性。如怀疑HCV抗体检测结果假阳性，可使用另一种抗体检测试剂再次检测确认抗体阳性结果。此外，在存在免疫功能抑制的患者中，比如存在艾滋病、恶性肿瘤化学治疗、造血干细胞移植、实体器官移植、血液透析、低Y-球蛋白血症、全身使用糖皮质激素等情况下，HCV抗体检测结果可能出现假阴性。对于近6个月内暴露于HCV的急性HCV感染者，也可出现HCV抗体检测结果的假阴性。如怀疑HCV抗体检测结果假阴性，应进行HCV核酸检测以确认感染情况。参考文献1.中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.丙型肝炎诊断:WS213-2018S.北京：中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，2018.2.WHO.GuidelinesonHepatitisBandCTestingM.Geneva：WorldHealthOrganization,2017.3.ChevaliezS.StrategiesfortheimprovementofHCVtestinganddiagnosis.ExpertRevAntiInfectTher.2019；17(5):341-347.4.ChevaliezS,PawlotskyJM.Newvirologicaltoolsforscreening,diagnosisandmonit
