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1、离体蛙心灌流,【目的要求】,1、学习斯氏离体蛙心灌流法。2、观察离子及药物等对离体心脏活动的影响。,【基本原理】,心脏的正常节律性活动需要一个适宜的内环境（如Na，K，Ca2等的浓度及比例、pH值和温度），内环境的变化直接影响到心脏的正常节律性活动。将失去神经支配的离体心脏保持于适宜的理化环境中（任氏液Ringer solution），在一定时间内仍能产生自动节律性兴奋和收缩。,离子对心脏活动的影响,改变任氏液的组成成分，离体心脏的活动就会受到影响。K+参与心肌细胞的复极化和自律细胞的4期自动去极化过程，其改变不仅取决于细胞内外K+浓度梯度，还与细胞膜对K+通透性有关，因此其影响是多方面的。C
2、a2+对Na+内流存在竞争抑制作用，称膜屏障作用，对静息电位无影响。Ca2+o，可使心肌细胞的兴奋性降低，传导减慢，收缩力增强。,在体心脏受交感神经和迷走神经的双重支配交感神经末梢释放去甲肾上腺素，与心肌细胞受体结合，使心肌收缩力加强，传导速度加快，心率加快；阻断剂心得安迷走神经末梢释放乙酰胆碱，与心肌细胞M受体结合，使心肌收缩力减弱，心肌传导速度减慢，心率减慢；阻断剂阿托品,【动物、器材与试剂】,蟾蜍或蛙、纱布、毁髓针、眼科镊、手术剪、眼科剪、蛙板、蛙钉、玻璃分针、滴管、细棉线、蛙心夹、铁支架、万能滑轮、小烧杯、斯氏蛙心套管、双凹夹、套管夹、张力换能器、生物信号计算机采集系统任氏液、0.65
3、%NaCl、2%CaCl2、1%KCl、1/10000肾上腺素、1/10000乙酰胆碱、阿托品、300U/ml肝素。,【方法与步骤】,1、仪器准备2、离体蛙心的制备3、连接实验装置4、实验观察,1、仪器准备,打开计算机生物信号采集系统，选择实验项目-循环实验-离体蛙心灌流。熟悉实验标记的使用。参考：生理模拟实验软件-离子和药物对离体蛙心的影响,2、离体蛙心的制备（斯氏蛙心插管法）,在左主动脉下方穿线，靠上端结扎，作插管时牵引用在主动脉干下方穿线，在动脉圆锥上方打一活结备用（用以结扎和固定插管）。,取蛙或蟾蜍，双毁髓后背位置于蛙板上，暴露心脏。仔细识别心脏周围的大血管。,左手提起左主动脉上方的结
4、扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉管壁剪一斜口（注意要剪破血管内膜，每次心缩时有血自切口涌出，但不要把血管剪断，剪口位置视套管尖端长度与心脏大小而定）。选择大小适宜的斯氏蛙心套管，盛入少量任氏液（内加一滴肝素溶液，套管内23cm高度）。左手用眼科镊提起切口缘，右手将注有任氏液的斯氏套管插入动脉干内，然后左手持左侧血管分支上的结扎线向外拉，右手将蛙心套管送入动脉圆锥。,当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍向后退（因主动脉内有螺旋瓣会阻碍插管前进），并将套管尾端稍向右主动脉方向及腹侧面倾斜，使插管尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，在心室收缩时经主动脉瓣进入心室。,注意插管
5、不可插得过深，插管的斜面应朝向心室腔，以免插管下口被心室壁堵住。此时可见血液冲入套管，并使液面随心脏搏动而上下移动，表明操作成功（否则需退回并重新插入）用滴管吸去套管中的血液，换新鲜任氏液。,稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧（不得翻液），再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。看清静脉窦的位置，在心脏的下方绕一线，将左右肺静脉及前后腔静脉一起结扎（注意切勿损坏静脉窦）。轻轻提起套管和心脏，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体。,用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致（1
6、.52cm，或在套管的下1/3处结一线作为标志，每次换任氏液时使液面与此线相平），即可进行实验。,其他方法技巧,用蛙心夹提起心尖，使心室与动脉圆锥约呈100-200的钝角，然后当心室缩紧时把套管平直往心室方向推进。当感觉套管进入心室后再把心尖放平，随即将套管稍向心室推进，调整合适位置，可见套管内液面随心跳而升降。,3、连接实验装置,将套管固定在支架上，用蛙心夹在心舒期夹住少许心尖部肌肉（不要夹多，以免夹破心室而漏液）。将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。勿使灌流液滴到传感器上。,调节记录仪器上的收缩曲线的幅度适中。,4、实验观察,1)记录正常心搏曲线。2)改用0.65%NaCl溶液灌
7、流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗23次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌流液面一致（下同）。,3)向套管内加26滴5%NaCl溶液，作好加药标记，观察心搏曲线的频率及振幅变化。当曲线出现明显变化时，应立即吸去套管中的灌流液，并做好冲洗标记，迅速用新鲜任氏液清洗23次，待心搏恢复正常。4)向套管内加12滴2%CaCl2溶液，作好加药记号，观察心搏曲线的频率及振幅变化。标记、冲洗至心搏恢复正常5)向套管内加入12滴1%KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同法更
8、换灌流液，待心搏恢复正常。,6)同法记录套管中加入12滴肾上腺素溶液(1/10000)后心搏曲线的变化。7)同法记录套管中加入12滴乙酰胆碱溶液(1/10000)后心搏曲线的变化。8)同法记录套管中先加入阿托品后再加12滴乙酰胆碱溶液(1/10000)后心搏曲线的变化。,【注意事项】,1、制备离体心脏标本时，勿伤及静脉窦。2、蛙心夹应在心室舒张期一次性夹住心尖，避免因夹伤心脏而导致漏液。3、每一观察项目都应先描记一段正常曲线，然后再加药并记录其效应。加药时应在心跳曲线上予以标记，以便观察分析。4、各种滴管应分开，不可混用。5、在实验过程中，插管内灌流液面高度应保持恒定；仪器的各种参数一经调好，
9、应不再变动。,6、标本制备好后，若心脏功能状态不好（不搏动），可向插管内滴加12滴2%CaCl2或1：10000肾上腺素，以促进（起动）心脏搏动。在实验程序安排上也可考虑促进和抑制心脏搏动的药物交换使用。7、给药后若效果不明显，可再适量滴加，并密切注意药物剂量添加后的实验结果。给药量必须适度，加药出现变化后，就应立即更换任氏液，否则会造成不可挽回的后果，尤其是K稍有过量，即可导致难以恢复的心脏停跳。8、谨防灌流液沿丝线流入张力传感器内而损坏其电子元件。,实验结果,CaCl2灌流,KCl灌流,1:10000 E灌流,4期 If、I CaT通道,4期自动去极速度,自律性,心率,与心肌1受体结合,C
10、a2+内流肌浆网释放Ca2+,兴奋-收缩耦联,收缩力,cAMP,1:10000 Ach灌流,与心肌M受体结合,K+外流,Ca2+内流,E-C耦联,收缩力,最大复极电位 4期K+外流,自律性,心率,Ca2+i,【思考题】,1、心脏灌流说明心肌的哪些生理特性？2、用实验说明内环境相对恒定的重要意义。3、试分析任氏液中适量的钠离子、钙离子与钾离子对心肌的作用。4、为何强调实验中保持灌流液面的恒定?灌流量对心脏活动会有什么影响？5、试想，活的机体在心交感神经兴奋或心迷走神经兴奋时对心脏会有什么影响？,实验拓展,温度的影响：把套管内换成4任氏液，同时作好标记，观察曲线变化，待效应明显后，即换入室温任氏液。待曲线恢复正常后，再进行下一项目。同法，换入40的任氏液，如上观察。或以冰块、40热水接触静脉窦，效果更明显。酸碱等药物的影响：加2.5%NaHCO31滴，混匀；加3%乳酸1滴，待效应明显后，再加1滴2.5%NaHCO3，观察曲线的变化。,
