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1、第17章 法医DNA分型（供医学专业本科教学用）,一、概述,1995年以前，北京市公安局的法医检验大多是通过化验血型，如现场出现的嫌疑人血型是O，就确定能够排除血型为A、B等血型的嫌疑人 现在，多项DNA检验技术用于常规办案，所有送到实验室的案子都需要进行DNA的检验。,案例,遗传物质的结构,染色体微带襻环30nm螺线管11nm染色质小纤维双链单链,人类基因组序列特点（1）,在发现了DNA的双螺旋结构后,即逐渐开始了对所有核酸单链上DNA序列的研究方法:酶切（RFLP等）;杂交分析（如FISH、放射性杂交等）直接测序 获得的结果：tctagagaga accatccttc agaaaggtta
2、 ctcttcctga gacaagtctg actgtcagtt tatgttctaa gcatgtctgt gtggccagta cattcagagt ggacagtctc tgagctgtta tctttccag agagggctct ctattcagat ggtagtggaa tagagtattc aaaacataca tgttattcag agggtgagaa atatctttat cttttcccg tgctttcttc ttggcctgga aacaaatctc ctgtttacgc ttcgatttga tcagactttg aatgtgtgtg aacatgattg atga
3、gaggct aaaaaagcc tcccaaaact caggagaggg ggaatctgtt cttagcccac ttctgacaaa tatcaatatc tgcttcctcc ccattgggat gctcctcaga caagggttaa,人类基因序列特点（2）,特点如下：核DNA有30亿个碱基，胞浆DNA有约1万多个碱基；能编码基因的DNA占20%，不能编码基因的DNA占80%；编码序列中,仍有90%不表达。即能表达的基因序列不到全基因组的2%，凡不能表达的序列被称为“垃圾序列”在人基因组的“垃圾序列”中，35%-45%是重复序列。假如基因组是一部电视剧，那么只有2分钟的正经节
4、目，却有98分钟的广告！,人类基因组序列特点（3）,人类基因组,核基因组3000Mb,线粒体基因组16.6kb,结构基因,基因间序列,假基因,调控基因,内含子,串联重复,散在重复,非编码区DNA,单拷贝DNA,重复序列DNA,编码区DNA,20%80%,10%90%,40%60%,从遗传角度来讲，除同卵孪生子外每个人的DNA分子都不一样。具体体现在编码区序列的不同和重复序列中重复次数的差异。,从遗传角度来讲，除同卵孪生子外每个人的DNA分子都不一样。具体体现在编码区序列的不同和重复序列中重复次数的差异。同一个体体内各种有核细胞都是由同一受精卵分裂而来，故在同一个体中各种有核细胞内所含的DNA都
5、是一样的。,作为基因载体的DNA分子 不同个体中的独特性 同一个体中的统一性,作为基因载体的DNA分子 不同个体中的独特性 同一个体中的统一性 法医DNA分析技术正是利用了DNA所具有的这两个特性，通过对生物检材中DNA遗传多态性的检验进行个人识别和亲权鉴定。当前成熟的法医DNA分型，主要是利用对重复序列的分析达到个人识别的。,二、最有价值的重复序列：STR（Short Tandem Repeats）位点,关于重复序列,重复序列在高等生物基因组中普遍存在,越高等的动物其重复序列就越多在人基因组的“垃圾序列”中，35%-45%是重复序列。如第7号染色体中，重复序列占57%；在人的每一条染色体末端
6、，存在一段6个碱基（TTAGGG）的重复序列，它重复了大约2501500次分为简单重复和串联重复两大类简单重复：如“CG”组合在人类基因组中到处存在，散在分布，共有近3万个CG；如“CA”重复、“GT”重复等串联重复：如第7号染色体上的一段序列，其核心序列为GATA，重复多次，形成 GATA GATA GATAGATA GATA GATA GATA GATA GATA,关于短串联重复（STR）序列,核心序列短（为2-6个碱基）重复次数少（一般重复8-40次）加上其5和3端的侧翼序列,整个STR位点长100-300bp左右,易于分析在人基因组中广泛存在，染色体定位明确分析结果简单,直接获得其重复
7、次数,易于命名。如案例中嫌疑人袁*的D8S1179位点的等位基因分别为13、15，即其核心分别重复了13、15次遵循孟德尔规律遗传，如果父亲的两个等位基因为纯合子即15，15，那么他必将其中之一传递给他的孩子,不同个体的重复序列存在差异,不同STR位点核心序列不同，重复次数也不同如D8S1179位点，张三的重复次数可能为12，12，而李四的重复次数可能为10，15；又如D21S11位点，张三的重复次数可能为28，30，而李四的重复次数可能为29，31如本案例中各分型结果：在受害者和嫌疑人之间，只是在D16S539一个位点上完全一致,13个STR位点的联合分析,如此分析多个个体的多个STR位点，
8、则不同个体间分型结果完全一致的几率极小联合分析多个这样的位点，则完全可以达到个人识别的能力计算结果表明，FBI(Federal Bureau of Investigation)推荐的13个STR位点联合分析，可达到99.9999%的个人识别效力,当前最常用的13个STR位点,分别为CSF1PO、FGA、TH01、VWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11,关于STR座位（位点）的命名,D*：第*号染色体S*：首次进入数据库的第*号单拷贝原始序列如D8S1179即第7号染色体上第1179个被登记的STR序列,三、
9、STR位点的分析：PCR方法（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应),3.1 PCR的基本原理 在体外条件下，利用DNA聚合酶的催化作用，以靶DNA作为模板，由一对引物引导DNA合成，使两引物间的靶DNA片段得到特异性的扩增。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。,DNA变性引物结合延伸一次扩增 结果 二次扩增,3.1 PCR的基本原理 在体外条件下，利用DNA聚合酶的催化作用，以靶DNA作为模板，由一对引物引导DNA合成，使两引物间的靶DNA片段得到特异性的扩增。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。所谓引物(primer)是由DNA合成仪人工合成的与待
10、扩增的DNA片段两翼互补的寡核苷酸片段(由几个或几十个碱基组成)。,3.1 PCR的基本原理 在体外条件下，利用DNA聚合酶的催化作用，以靶DNA作为模板，由一对引物引导DNA合成，使两引物间的靶DNA片段得到特异性的扩增。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。所谓引物(Primer)是由DNA合成仪人工合成的与待扩增的DNA片段两翼互补的寡核苷酸片段(由几个或几十个碱基组成)。在进行PCR时，DNA的合成只能在两引物之间沿待扩增的DNA模板进行，从而得到两条与模板DNA序列完全互补的DNA新链。,3.2 PCR的反应过程 将耐热DNA聚合酶（通常使用的是Taq DNA polymeras
11、e）、引物、脱氧核糖核苷酸（包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP）、待扩增的模板DNA及提供最佳反应条件的缓冲系统等按照适当的比例混合组成的反应体系装于扩增管中。通过DNA扩增仪以不同的温度循环进行扩增。,每个循环周期一般包括三个基本步骤：模板DNA变性：即在940960C高温下使模板DNA发生热变性，打开DNA双链。,每个循环周期一般包括三个基本步骤：模板DNA变性：即在940960C高温下使模板DNA发生热变性，打开DNA双链。退火：降低温度(50-600C)使引物与模板DNA上的互补序列结合。由于反应体系中引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，因此退火过程中因竞争作用而使引物与模板D
12、NA上的互补序列杂交结合，而不是模板DNA自身两条单链的重新结合。,每个循环周期一般包括三个基本步骤：模板DNA变性：即在940960C高温下使模板DNA发生热变性，打开DNA双链。退火：降低温度(50-600C)使引物与模板DNA上的互补序列结合。由于反应体系中引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，因此退火过程中因竞争作用而使引物与模板DNA上的互补序列杂交结合，而不是模板DNA自身两条单链的重新结合。引物延伸：在700C左右的反应温度下，通过DNA聚合酶的作用，以待扩增的靶DNA片段为模板，将相应的单核苷酸连接到引物的3末端，使引物的3末端沿模板DNA延伸，合成与模板DNA完全互补的新DNA
13、链。,DNA变性引物结合延伸一次扩增 结果 二次扩增,当一个反应周期结束，靶DNA片段即可增加一倍。从理论上讲，随反应周期的增加，靶DNA片段呈指数增加。如经过n个周期的循环，则靶DNA片段可增至2n倍。,DNA,扩增,电泳分离,显带,3.3 STR位点的PCR结果,D3S1358 12-20,D12 VWA 13-22,STR位点PCR产物照片,返回,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程而在体外快速、大量获取核酸DNA的方法，导致了分子生物学界的一场革命，它使人们梦寐以求的体外无限扩增脱氧核糖核酸(DNA)片段的愿望变成现实
14、。由美国科学家Kary Mullis于1983年发明，Kary Mullis因而获得了1993年诺贝尔化学奖。PCR技术现已经被广泛地应用于生命科学的各个领域中。,3.4 PCR总结,利用PCR技术，可以在短时间内将微量生物样本中的靶DNA片段扩增几百万倍，使得对DNA片段的分析变得轻而易举。法医物证检验也因此进入了一个全新的时代。,四、不同于STR技术的其他分析方法,4.1 DNA指纹,人类将具有高度个体特征的手指皮纹(指纹)应用于认定罪犯和侦查破案已有100多年的历史,对“DNA指纹”的应用则是最近十几年的事。其在法医学中的应用始于1985年第一代个人识别技术，现已经被STR分型技术取代,
15、1984年，英国莱斯特(Leicester)大学的Jeffreys教授等从人类DNA的肌红蛋白基因第1内含子中发现了一个核心序列为16碱基对(bp)的串联重复序列，重复次数高度可变，在人群中重复从4到几十次不等。,1984年，英国莱斯特(Leicester)大学的Jeffreys教授等从人类DNA的肌红蛋白基因第1内含子中发现了一个核心序列为16碱基对(bp)的串联重复序列，重复次数高度可变，在人群中重复从4到几十次不等。他们用重组DNA技术克隆了这段序列，制备出了33.6和33.15两种“核心”序列重复次数不同的DNA探针。,Jeffreys用不能切割上述探针所含核心序列的限制性内切酶 Hi
16、nf去消化人类基因组DNA（背景知识：个体基因组DNA由一种限制酶切割后，产生的一系列大小不等的DNA片段。不同个体基因组DNA的酶切割点多少和分布位置不相同，产生的片段数量和大小不相同。）,然后用琼脂糖凝胶电泳将酶切后的DNA片段进行分离，经Southern印迹转移后，再用同位素(32P)标记的DNA探针与分离后的酶切片段做分子杂交。将杂交后的尼龙膜与X光片一起作放射自显影，最后获得了由黑色和灰色条带所构成的杂交图谱。,结果发现，不同个体DNA杂交图谱的黑色及灰色条带是以不同模式排列的，具有显著的个体差异。,DNA,内切酶消化,电泳分离,探针杂交显带,10例无关个体的DNA指纹图谱,计算发现
17、，如果单用 33.15 DNA探针，个体间相关概率小于310-11，即2个无关个体间DNA杂交图谱完全相同的机会小于1300亿。,计算发现，如果单用 33.15 DNA探针，个体间相关概率小于310-11，即2个无关个体间DNA杂交图谱完全相同的机会小于1300亿。若用 33.15 和 33.6 两种探针，则个体间的相关概率小于510-19，其倒数远远大于全世界人口总数.,计算发现，如果单用 33.15 DNA探针，个体间相关概率小于310-11，即2个无关个体间DNA杂交图谱完全相同的机会小于1300亿。若用 33.15 和 33.6 两种探针，则个体间的相关概率小于510-19，其倒数远远
18、大于全世界人口总数.说明世界上没有两个人的DNA指纹是完全相同的(除了同卵孪生子外)。,英国自然(Nature)杂志1985年发表了Jeffreys研究DNA个体特征的论文。Jeffreys在文章中将用上述方法检测所获得的限制性片段长度多态性(RFLP)的杂交图谱称为“DNA fingerprints”，即所谓“DNA指纹”。,经家系调查，DNA指纹是按盂德尔定律遗传的。1985年，Jeffreys首次应用DNA指纹技术解决了一宗涉及移民问题的亲权鉴定案。,一例伤害致死案件的DNA指纹分析,DNA指纹的优缺点,最显著的特点是具有很高的鉴别能力，其杂交图谱显示出多条个体特异谱带，即使只使用一种探
19、针，也可根据杂交图谱准确判定两份样本是否来源于同一个体。对检材要求较高，不能分析降解的DNA，判读和结果解释比单位点探针困难。,4.2 DNA纹印(DNA Profile),原理与DNA指纹类似不同之处在于探针序列,序列中含有不重复序列,以定位某一个具体位点,DNA纹印原理 DNA指纹原理,一例案件的DNA纹印图谱,单位点探针只能与DNA分子上的单一位点杂交，纯合时出现一条杂交带，杂合时出现两条带，故个人识别能力不如多位点探针。为了提高单位点探针的鉴别能力，可以用两种或两种以上的单位点探针对同一份检材进行检测。,DNA纹印优点：图谱容易判读，每个单位点探针只能检出12条带。,DNA纹印优点：图
20、谱容易判读，每个单位点探针只能检出12条带。用单位点探针很容易了解到DNA指纹图上的杂交带来自哪一个位点，便于统计分析。,DNA纹印优点：图谱容易判读，每个单位点探针只能检出12条带。用单位点探针很容易了解到DNA指纹图上的杂交带来自哪一个位点，便于统计分析。易于分析混合斑的DNA样品。多位点探针所得的杂交图谱上的条带较多，如果两个或两个以上的样品混合在一起(在凶杀、强奸、轮奸等案件中常出现这种情况)，所得的杂交图谱上的条带更复杂，难以分析结果。而用单位点探针检测时，因每一样品最多只出现两条杂交谱带，对于混合样品检测结果的分析就显得较为方便。,DNA纹印优点：图谱容易判读，每个单位点探针只能检
21、出12条带。用单位点探针很容易了解到DNA指纹图上的杂交带来自哪一个位点，便于统计分析。易于分析混合斑的DNA样品。多位点探针所得的杂交图谱上的条带较多，如果两个或两个以上的样品混合在一起(在凶杀、强奸、轮奸等案件中常出现这种情况)，所得的杂交图谱上的条带更复杂，难以分析结果。而用单位点探针检测时，因每一样品最多只出现两条杂交谱带，对于混合样品检测结果的分析就显得较为方便。可分析部分降解的DNA，能检测分子量较小的DNA片段(1-4kb)，而多位点探针所检测的DNA片段通常在4-24kb之间，若DNA片段小于4kb一般不能检测。,DNA纹印优点：图谱容易判读，每个单位点探针只能检出12条带。用
22、单位点探针很容易了解到DNA指纹图上的杂交带来自哪一个位点，便于统计分析。易于分析混合斑的DNA样品。多位点探针所得的杂交图谱上的条带较多，如果两个或两个以上的样品混合在一起(在凶杀、强奸、轮奸等案件中常出现这种情况)，所得的杂交图谱上的条带更复杂，难以分析结果。而用单位点探针检测时，因每一样品最多只出现两条杂交谱带，-对于混合样品检测结果的分析就显得较为方便。可分析部分降解的DNA，能检测分子量较小的DNA片段(1-4kb)，而多位点探针所检测的DNA片段通常在4-24kb之间，若DNA片段小于4kb一般不能检测。可避免与其他物种的DNA杂交。单位点探针不能与其他物种的DNA杂交，这对于法医
23、检案具有重要意义。而多位点探针除了能与人类DNA杂交外，还可与其他动植物DNA杂交。,不同DNA长度分析技术综合评价,Amp-FLP DNA profiling DNA fingerprinting VNTR或STR DNA纹印 DNA指纹特异性 高 高 低灵敏度 极高 高 低准确性 高 高 受检材影响大可比性 高 中 低鉴别能力 单个检测 低 中 高 多个检测 高 高 高技术要求 低 中 高,4.3 序列差异分析技术,是指人DNA序列中某位点上碱基排列的个体差异。如HLA基因:I类基因Exon2共270个bp，不同人种间可以相差30个bp线粒体DNASNP位点，如：,主要分析方法,酶切 以D
24、NA限制性内切酶酶切，可见位点增多、消失或移位，酶切后所产生的限制性片段数目及长度发生改变。DNA指纹即是Hif I酶切后所获得的多态性分析结果等位基因特异性探针杂交技术测序,线粒体DNA分析序列差异分析最成功的应用,呈环状，共16000多个碱基序列中存在高变区I和高变区II对汉族111名无关个体作调查HV-I区共443bp长，111人中有103人彼此不同；HV-II区共375bp长，111人中有69人彼此不同母系遗传、拷贝数多，在个人识别中有重要应用,未来方向：DNA芯片,第三代个人识别技术，将主要利用序列多态性原理,目前尚处于开发阶段含几十乃至几百个SNP位点序列为探针的芯片当将待检的样品
25、DNA加入到这种DNA芯片上时，样品DNA链只能与芯片上与之互补的另一半拉链结合，激光对芯片上完全匹配的DNA双链进行扫描，即可测出样品DNA的序列。利用DNA分子碱基互补的特性，一次即可获得被检样品的大量SNP位点的分型结果,设每个SNP位点在人群中的分布频率为0.5，则无关个体在n个SNP位点上完全相同的机会为0.5n经计算，同时检测30-40个这样的SNP位点，则地球上没有任何两个人的检测结果完全一致,DNA芯片优点,等位基因一般只有两个，分型结果明确，非此即彼，易于判型易于实现自动化一次可获取大量信息,预期结果,现场检材SNP芯片分型,嫌疑人SNP芯片分型,“基因身份证”!,五、STR
26、分型结果数据库DNA数据库,在进行亲权鉴定和法医生物物证检材的个体识别方面，DNA分析技术的实用价值已得到世界各国司法机关的公认。当建立起涵盖面广泛的DNA数据库之后，技术人员只需将现场检材的DNA分析数据与库存数据进行查询比对，即可直接找到作案者。不仅大大地加快了利用现场生物物证材料排查嫌疑对象的速度，也进一步丰富了侦查破案的手段。,5.1 DNA数据库的定义,指利用计算机强大的存储功能及高效的信息分析功能，将标准化的DNA分型检验结果按照同一的数据格式存储起来而建立的以侦查为目的的数据信息系统。DNA数据库的建立和应用，是法医DNA技术发展的又一里程碑。在DNA数据库中，DNA高度的个体特
27、异性和计算机信息分析的高效性得到了很好的结合，可以实现现场获得的生物检材与库内存储的相关人群DNA分型数据的快速检索比对。,5.2 世界上第一个DNA数据库 1995年，英国议会通过立法决定建立国家DNA数据库，英国内政部决定将数据库建在英国国立法庭科学实验中心(FSS)。数据库分为嫌疑人数据库和现场数据库。法律规定，只要警方将某人列为嫌疑人，就可合法地提取其DNA进行检验并将数据输入嫌疑人库储存。一旦嫌疑解除，应立即将其数据删除。现场库的数据来源是案件现场提取的DNA样本。应用这两个数据库，不仅可以通过案件现场DNA与嫌疑人库DNA查出作案人，而直接破案；也可通过比对现场DNA与现场库DNA
28、数据进行串并案件。,1994年美国国会正式通过了关于建立DNA数据库的法案。至1996年全美已有40个州参与了DNA数据库。在组织形式上，DNA数据库分为地方、州、国家三个等级。,我国在建立DNA数据库方面现已开始着手建库的一些前期准备工作。1999年4月，公安部科技局在北京召开了“全国法庭科学DNA检验技术标准与质量控制研讨会”，会议就在我国建立DNA数据库的问题进行了讨论。1999年9月，由国家计委批准立项，司法部法庭科学技术研究所承担的科研项目“罪犯DNA数据模式库”在上海通过了专家鉴定。,5.3 数据库与质量控制,在应用DNA分析技术中，一个极为重要的问题就是如何确保鉴定结果的准确性。
29、在开始阶段，法医DNA分析技术是边开发边应用，当人们对于这项新技术近乎狂热的追求和迫不及待的仓促应用中，技术标准化的问题曾一度被忽略了。由于缺少法庭、律师和DNA实验室统一遵循的一套标准，有关DNA分析结果能否作为法庭证据的问题曾在美国引发了一场所谓“脱氧核糖核酸大战”。,美国刑事实验室主任协会(ASCLD)亦针对法医DNA分析制定了专门的质量控制和质量保证标准。英国、德国等欧共体国家也先后制定了自己的技术标准，对DNA分析的位点、引物序列、片段长度、等位基因数目及统计和计算方法等作出了详细的规定。目前，美国、英国、欧共体国家、日本、香港、澳大利亚等国家和地区的DNA实验室均采用了大致相似的技
30、术标准和质量控制体系。,我国公安机关、检察院、法院及各医学院校的法医学院系均建立了各自的DNA实验室，基本形成了中国法医学系统的DNA分析鉴定框架。但由于没有专门的管理机构，亦未制定有关的管理法规、技术规范和实施准则，各实验室之间不仅在实验装备和技术力量上存在较大差异，且所应用的技术方法、试剂种类也不一致，在结果解释、统计数据采用和概率计算方法等也不完全相同，在很大程度上制约了DNA技术在我国司法实践中的应用和发展。尽快制定和实施我国法医DNA分析技术的标准化方案，在DNA分析中建立完备的质量控制和质量保证体系已成为一项十分迫切的任务。,六、DNA多态性的产生机制探讨,定义,在随机交配无血缘关
31、系的群体中，不同个体的同一段DNA存在相对差异的现象。串联重复序列构成了长度多态性单个碱基变异构成了序列多态性,分 类,DNA多态性可分为两大类序列多态性：SNP位点等长度多态性:STR位点,三代DNA多态性遗传标记,第一代：酶切位点多态性（RFLP）第二代：STR位点第三代：SNP位点,原因,基因组序列出现变异是生物遗传的基本特征之一,也是生物进化和适应环境的必然结果在生物繁衍、进化的过程中，遗传物质DNA不断地发生突变(点突变、片段的插入和缺失等)，DNA复制时不平衡交换和序列的滑动、染色体的分离、自由组合等，引起DNA中核苷酸排列顺序发生改变，产生了个体遗传差异，造成不同个体间千差万别,意义,具有重要的生理和病理意义是人类对于疾病、环境及应激的易感性千差万别的遗传基础是人类对于环境、毒素及药物的耐受性和反应性千差万别的遗传基础,参考文献,四川大学华西基础医学与法医学院刘敏教授编著的同类课件侯一平主编，高等教育出版社出版法医学王保捷主编，人民卫生出版社出版法医学,
