线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书.docx

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1、线粒体复合体II试剂盒说明书微法lo0*/96样注*:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义,线粒体复合体II又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸朝化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADHa后者进一步还原氧化型辅旅Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递桂的支路。刑定原理:复合体Il的催化产物还原型辅SSQ可进一步还原2,6二氯呷|跺酚,2.6-二氯呀噪酚在605nm有特征吸收峰,通过检测2.6-二氯呻味酚的减少速率来计尊该酶活性.需自备的仪器和用品:可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/9

2、6孔板、研钵、冰和蒸憎水。试剂组成和配制:试剂一:液体100mLxl瓶,-2(TC保存:试剂二.:液体20mLkl瓶,-201C保存;试剂三:液体.5mLkl支,-20IC保存;试剂四:液体25mLxl瓶,4t保存;试剂五:粉剂I支,-2(C保存;试剂六:液体25mLxl瓶,4寸保存;样本的前处理:组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入ImL试剂一和IoUL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,4寸离心5min。3、弃沉淀,将上清液移至另一寓心管中,IlOOOg,4X:离心IOmin(I4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可

3、用于测定从线粒体泄漏的复合体II(此步可选做)。5、步骤中的沉淀即为线粒体,加入200UL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体II酶活性测定.湖定步事:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至6O5nm,蒸情水调零。2、样本测定1)工作液的配制:临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解,置于37P(哺乳动物)或25P(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-2(TC保存,禁止反复冻融。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入K)UL样本、251IL试剂六和200UL工作液,立即混匀,记录6O5m处初始吸光值Al和

4、2min后的吸光值A2,计算AA=Al-A2.重合体II活力单位的计算:a.使用雄石英比色Hl测定的计算公式如下:(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol26二氯引咪酚定义为一个Sl活力单位。复合体11活力(nmol/minmgprot)=(AV反总+d)109(VtCpr)T=559ACpr此法需要自行测定样本蛋Fl质浓度。(2)按样本鲜而.计算单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmo)2.6-二氯弓1喙酚定义为一个酶活力单位。复合体11活力(nmol/min/g鲜sft)=AA*V反总SXd)xKT(WxV样V样总)+T=113*AW(3)按细菌或细胞密度计算单

5、位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2.6-二氯呼I咪酚定义为一个酶活力单位。复合体11活力(nmolmin104ceD=AV反总+(d)109(500V样V样总)+T=0.226*AAV反总:反应体系总体积,2.35xlO4L:2.6-二氯31噪酚摩尔消光系数,2.1104Lmol/cm:d:比色皿光径,1cm:V样:加入样本体积,OOlmL:V样总:加入提取液体积,0.202mL:T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mgmLiW:样本质量,g:500:细胞或细菌总数,500万。b.使用96孔板海定的计算公式如下:(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分

6、钟消耗1nmol2,6二氯丐I咪酚定义为一个酶活力单位复合体II活力(nmol/min/mgprot)=AAV反总+(cxd)10,(CprV样)+T=Il18*AA-CPr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2)按样本鲜市计算单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol2,6-二氯解味酚定义为一个酶活力单位。复合体11活力(nmol/min/g鲜垂网AAXV反总+(d)109(WVWV.)T=226AW3)按细菌或细胞密度计算单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2,6-二氯阿咪酚定义为一个酶活力单位。复合体H活力(nmolmin104CellHAAXV反总+(d)109(500V样+V样总)=O.452MAV反总:反应体系总体积,2,351(HL:2,6-二氯喷噪酚摩尔消光系数,ZlxlO4L/molcmsd:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01mb;V样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

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