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1、化药质控分析方法验证和杂质研究,Venturepharm PDS,2,质控分析方法验证,1.方法验证的主要内容,Venturepharm PDS,3,质控分析方法验证,1.方法验证的主要内容,Venturepharm PDS,4,1.方法验证的主要内容,验证内容：专属性 线性 范围 准确度 精密度（重复性、中间精密度和重现性）、检测限和定量限 耐用性 系统适用性,中国药典2010年版二部附录 A 药品质量标准分析方法验证指导原则,Venturepharm PDS,5,1.方法验证的主要内容,专属性方法不受杂质、降解物、辅料的影响，可正确鉴定被分析物鉴别反应：仅被分析物呈正反应，阴性对照呈负反应
2、，结构相似及组分中的有关化合物也呈负反应。杂质检查：加入的杂质可与共存物质分离并被检出 与原理不同的可信方法比较；强制降解含量测定：比较加入杂质或辅料前后的测定结果 与可信方法比较测定结果（强制降解样品）空白对照应无干扰，主成分与各杂质峰（该杂质峰与其他峰）R2,Venturepharm PDS,6,1.方法验证的主要内容,专属性试验中需要注意的问题波长的选择；每次试验时必须运行空白样品；试剂、玻璃容器、流动相和过滤介质可能会影响方法的专属性。,Venturepharm PDS,7,1.方法验证的主要内容,线性在设计的测定范围内，样品浓度与响应值呈线性关系线性是定量测定的基础，设计定量测定的项
3、目，如杂质定量检查、含量和溶出方法均需要验证其线性可用同一贮备液精密稀释后配制，或分别精密称样配制。,Venturepharm PDS,8,1.方法验证的主要内容,线性在设计的测定范围内，样品浓度与响应值呈线性关系含量测定：在80%-120%浓度范围内配制样品。（考虑含量浓度、含量均匀度浓度及溶出的浓度，实际操作采用20%-200%）相关系数R0.998，Y轴截距在100%响应值的2%以内，RSD2.0%杂质定量测定：在定量限至一定浓度范围内配制样品。（考虑实测该杂质的值）相关系数R0.990，Y轴截距在100%响应值的25%以内,RSD10%,Venturepharm PDS,9,1.方法验
4、证的主要内容,范围能达到一定准确度、精密度和线性的浓度区间，为规定值涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证，如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。分析方法的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定，无特殊要求时，通常采用以下标准：,Venturepharm PDS,10,1.方法验证的主要内容,范围能达到一定准确度、精密度和线性的浓度区间，为规定值半成品或成品含量测试：80%-100%或更宽含量均匀度：70%-130%，据剂型特点有差异溶出度：限度的20%，或下限的-20%至上限的+20%定量杂质：规定限度的20%，或采用峰面积归一化法与含量同测
5、时，为杂质限度的-20%至含量上限的+20%,Venturepharm PDS,11,1.方法验证的主要内容,准确度方法测定结果与真实值或参考值的接近程度，用回收率表示准确度是定量测定的必要条件，涉及到定量测定的检测项目均需要验证其准确度，如杂质定量测定、含量和溶出方法。分析方法的准确度能够确保：样品中的待测物全部溶解待测物全部从检测器中检出,Venturepharm PDS,12,1.方法验证的主要内容,准确度方法测定结果与真实值或参考值的接近程度，用回收率表示配制三个浓度下各三个样品，共九个样品平行两次测定 回收率：辅料+对照品 加样回收率：样品+对照品（扣除本底值）Q：制剂中某已知杂质的
6、回收率如何测定？(含已知量被测物的各组分混合物)含量测定：配制80%、100%和120%三个浓度。回收率在98.0%-102.0%之间，RSD 2.0%定量杂质：配制浓度根据有关物质定量限和该杂限度。回收率在80%-120%之间（杂质浓度为定量限时放宽至70%-130%），RSD 10%,Venturepharm PDS,13,1.方法验证的主要内容,准确度原料药：可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定；用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较,Venturepharm PDS,14,1.方法验证的主要内容,准确度制剂：用含已知量被测物的各组分混合物进行测定；如不能得到
7、制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定（加样回收试验法）用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较,Venturepharm PDS,15,1.方法验证的主要内容,准确度杂质：往样品中加入已知量的杂质进行测定；若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的或药典的分析方法获得的结果进行比较。,Venturepharm PDS,16,1.方法验证的主要内容,精密度多次取样测定同一均质供试品所得结果间的接近程度使用偏差d、标准偏差SD和相对标准偏差RSD表示偏差 d=xi-x 测量值与平均值之差标准偏差 相对标准偏差,Venturepharm PDS
8、,17,1.方法验证的主要内容,精密度多次取样测定同一均质供试品所得结果间的接近程度使用SD和RSD表示时取样测定次数应至少6次。重复性：同一分析人员在相同条件下测定结果的精密度；可采用3样各测3次或1样测6次 含量测定RSD 2.0%，杂质定量RSD 15%中间精密度：同实验室的不同人员、时间和设备测定结果的精密度 含量测定RSD 2.0%，杂质定量RSD 20%重现性：不同实验室不同分析人员测定结果的精密度,Venturepharm PDS,18,1.方法验证的主要内容,检测限和定量限被分析物可被检测和被准确定量的最低值检测限：3S/N；定量限：10S/NS主峰信号；N主峰附近1-3min
9、处的噪音Q:含量、溶出测定？（LOD/LOQ）杂质定性测定？定量测定？（LOD/LOQ）,Venturepharm PDS,19,1.方法验证的主要内容,耐用性测定条件发生微小变动时,测定结果不受影响的承受程度变动因素：含量测定：MP5%;pH0.2%;柱温5;v20%有关物质：MP5%;pH0.2%;柱温5;v20%;5nm;三根色谱柱若测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明。可接受标准：含量（有关物质）测定主峰（各杂质峰）的拖尾因子2.0；主峰与杂质峰（杂质峰与其它成分峰）达到基线分离；各条件下测得结果（n=6）的RSD 2.0%,Venturepharm PDS,20,1.方法验证的主
10、要内容,耐用性通过对改变条件后与标准条件下结果的比较来评估方法的耐用性，改变条件后与标准条件下的结果的差异计算公式如下：Difference%=100-100Rm/Rs Rm为改变条件后的含量结果；Rs为标准条件获得的含量结果可接受标准：原料药与制剂：主成分含量差异1.5%杂质：,Venturepharm PDS,21,1.方法验证的主要内容,系统适用性对整个系统（分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品）进行评估的指标含量测定/杂质检查配制6份同浓度供试品/杂质溶液进行分析，结果可接受的标准如下表所示,Venturepharm PDS,22,不同分析方法对验证项目的要求：,Venturepha
11、rm PDS,23,方法再验证,某些情况下，需要对分析方法再次进行全面或部分验证，以保证分析方法可靠。验证内容由改变程度决定。原料药合成工艺改变可能引入新杂质，验证杂质检查法和含量测定方法的专属性；原料药来源变更可能影响杂质及含量测定的专属性和准确度，需对杂质检查法和含量测定进行再验证；制剂处方组成改变、辅料变更可能影响鉴别专属性及含量测定的准确度，需验证鉴别和含量测定方法；质量标准中部分内容变化，如LC测含量的波长改变重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证。,Venturepharm PDS,24,质控分析方法验证,1.方法验证的主要内容,Venturepharm PDS,
12、25,2.含量方法验证可接受标准,准确度配制80%、100%、120%供试品各三份，分别测定其含量；各浓度下测得的平均回收率在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的 RSD2.0%线性取80%-120%（或50%-150%）浓度范围内的6份供试液；测得回归线的相关系数R0.998，Y轴截距在100%响应值的2%以内，响应因子的RSD2.0%。重复性6份相同浓度供试液，1人在尽可能相同的条件下测定，测得6份供试液含量结果的RSD 2.0%中间精密度6份相同浓度供试液，分别由2人用不同仪器测定，测得12个含量结果RSD 2.0%专属性空白对照应无干扰，主成分与各有关物质峰分离度R2，主峰纯
13、度因子980,Venturepharm PDS,26,2.含量方法验证可接受标准,检测限主峰与噪音峰信号的强度比S/N3定量限主峰与噪音峰信号的强度比S/N10，6份定量限浓度溶液测得主峰保留时间的RSD 2.0%耐用性考察MP5%;pH0.2;柱温5;V20%时色谱行为变化，各测2次；主峰的拖尾因子2.0；主峰与杂质峰达到基线分离；各条件下测得结果（n=6）的RSD 2.0%系统适用性配制6份同浓度供试品溶液；主峰峰面积RSD 2.0%，保留时间RSD 1.0%,拖尾因子2.0，理论塔板数符合质量标准规定，主峰与杂质峰达到基线分离。,Venturepharm PDS,27,质控分析方法验证,
14、1.方法验证的主要内容,Venturepharm PDS,28,3.有关物质方法验证可接受标准,准确度根据有关物质定量限和该杂限度，配制三个浓度的溶液各三份。各浓度下的平均回收率在80%-120%之间（杂质浓度为定量限时放宽至70%-130%），RSD 10%线性在定量限至一定浓度范围（考虑实测该杂的值）内配制6份样品；测得回归线的相关系数R0.990，Y轴截距在100%响应值的25%以内，响应因子的RSD 10%。重复性6份杂质浓度相同的供试液（一般为0.1%），1人测定，测得含量结果RSD 15%中间精密度6份杂质浓度相同供试液（一般为0.1%），分别2人用不同仪器测定，测得12个含量结果
15、RSD 20%,Venturepharm PDS,29,3.有关物质方法验证可接受标准,专属性空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰分离度R2检测限S/N3定量限S/N10，6份定量限浓度溶液测得杂质峰保留时间的RSD 2.0%，峰面积RSD 5.0%耐用性考察MP5%;pH0.2;柱温5;V20%；5nm及使用三根不同批号色谱柱时色谱行为变化，各测2次；各杂质峰的拖尾因子2.0；杂质峰与其他峰达到基线分离；各条件下测得结果（n=6）的RSD 2.0%，杂质含量绝对值在0.1%以内。,Venturepharm PDS,30,3.有关物质方法验证可接受标准,系统适用性配制6份同浓度供试品溶液；主峰峰
16、面积RSD 2.0%，保留时间RSD 1.0%,拖尾因子2.0，理论塔板数符合质量标准规定，主峰与杂质峰达到基线分离。溶液稳定性配制对照品溶液和供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，室温与冰箱冷藏室（4）中，在1、2、3、5和7天时分别平行测定两次主成分和杂质的含量，主成分含量变化绝对值2.0%，杂质含量绝对值在0.1%以内，不得出现新的大于报告限度的杂质。,Venturepharm PDS,31,质控分析方法验证,1.方法验证的主要内容,Venturepharm PDS,32,4.溶出方法验证,完整验证内容：溶出介质的选择 溶出介质体积的选择 溶出方法（转篮法与桨法）的选择 转速的选择
17、 溶出量测定方法验证 溶出度均一性试验（批内）溶出重复性试验（批间）,溶出度测定方法选择,Venturepharm PDS,33,溶出介质：通常采用：水、0.1mol/L盐酸、缓冲液（pH38为主）；在上述介质均不能完全溶解的难溶药物可加入适量表面活性剂。不能简单通过主药在各溶剂中的溶解度确定终介质，因工艺的选择、辅料的加入会改变主药在不同溶剂中的溶解行为。仿制药须与对照制剂进行溶出曲线对比，采用f2因子评价，介质除终介质外，还应选择水、0.1mol/L盐酸、pH3.8醋酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液及pH7.27.4磷酸盐缓冲液进行比对溶出介质体积：需使药物符合漏槽条件，大杯法常用500
18、-1000ml，小杯法常用100-250ml。,4.溶出方法验证溶出度测定方法选择,Venturepharm PDS,34,转速：通常转篮法选择50rpm-100rpm，桨法选择50rpm-75rpm。转速低于25rpm和超出150rpm通常是不被接受的介质、方法和转速的选择由溶出曲线的测定结果确定。单点测定不能很好区分不同处方和工艺的溶出情况，亦影响溶出拐点的确定。溶出度取样时间常选择溶出曲线拐点后推1020min，如果时间太长或较短，可通过适当提高或减低转速等手段等重新测定溶出曲线。不建议采用高转速或延长取样时间，若取样时间与拐点相距较远，易导致溶出度测定区分能力不明显。批间均一性是考察制
19、剂工艺稳定性及溶出方法重复性的重要指标，建议采用三批样品进行均一性考察,4.溶出方法验证溶出度测定方法选择,Venturepharm PDS,35,溶出方法验证包括：准确度（回收率）、精密度、专属性（辅料、胶囊壳等的干扰试验）、线性和耐用性等。溶出量测定所用介质与含量测定溶剂不一致；溶出量测定浓度与含量测定浓度不一致；溶出度测定为胶囊剂，或需除去包衣、薄膜衣后测定含量的片剂 均需重新进行溶出量测定方法验证。需要注意：范围为限度的20%，回收率高、中、低常设为50%、限度浓度、100%；测定干扰2%以下可以忽略，25%可考虑在限度上适当提高，超过5%以上测定方法不可取。胶囊壳产生干扰需进行囊壳消
20、除试验，干扰较大时建议采用HPLC法,4.溶出方法验证溶出量测定方法验证,常常为“见 含量测定 项下”,Venturepharm PDS,36,吸附验证方法（滤膜滤孔应0.8m）：取溶出液过滤，舍去不同体积的初滤液后测定，观察响应值的变化。取样后，一部分不过滤，直接采用高速离心，取上清液测定；另一部分采用过滤法，取所得续滤液测定；考察两结果差异。取对照品溶液，经滤膜过滤后，与原溶液进行比较，观察结果变化。发生吸附的品种往往是主药难溶于水，需要进行微粉化等处理制成制剂，使得粒径变小比表面能变大，与滤膜吸附作用明显；对于小规格制剂，在溶出液中的主药浓度低，达饱和所需初滤液体积大大增加，干扰也较大。
21、吸附量在2%以下可以忽略，否则需明确处理方式。,4.溶出方法验证滤膜吸附的验证,Venturepharm PDS,37,其他：介质脱气温度控制取样位置等,4.溶出方法验证,Venturepharm PDS,38,质控分析方法验证,参考资料化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则中国药典附录A 药品质量标准分析方法验证指导原则含量测定分析方法验证的可接受标准简介，黄晓龙有关物质分析方法验证的可接受标准简介，黄晓龙浅谈溶出度检查方法的建立，王亚敏化学药品普通口服固体制剂溶出度方法验证易忽视的几个问题，郑国刚化学分析方法验证，王彦忠,Venturepharm PDS,39,校正因子研究,杂质定量方法
22、：峰面积归一化法、自身对照法、加校正因子的主成分自身对照法、杂质对照品法（外标法）。绝对校正因子：单位响应值（峰面积）所对应的被测物质的量；相对校正因子：某物质与所选定的参照物质的绝对校正因子之比。优势：不需长期提供标准物质。劣势：受仪器和色谱条件影响较大，需要进行验证。,Venturepharm PDS,40,校正因子研究,校正因子的测定（1）提供特定杂质和主成分的标准物质（量值准确）（2）校正因子测定方法要与最终确定的质量标准方法一致（3）检测波长选择要合适,Venturepharm PDS,41,校正因子研究,单浓度点测定：制备适当浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液，分别进样测定，照校正因子定义计算多浓度点测定：制备适当的高、中、低三水平浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液（涵盖定量限、标准限度），分别进样测定，计算RSD，求平均值，得到校正因子。标准曲线法测定：精密称取杂质对照品和主成分对照品，分别制备系列溶液（涵盖定量限、标准限度），分别进样后，按最小二乘法以进样量对响应值（峰面积等）进行线性回归，求得两条标准曲线，两曲线斜率之比即为校正因子。,Thank You!,
