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1、酶类药物,酶类药物,一.酶类药物的概述二.酶类药物的提取和纯化三.重要酶类药物的制备,酶是生物体内具有生物催化活性的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。绝大多数酶的本质是蛋白质或蛋白质与辅酶的复合体。由于酶专一性强及催化效率高，使其在疾病的治疗等方面具有针对性强，疗效高等特点。,第一节 概述,一、药用酶类的概述,（一）酶的特性酶是由活细胞产生的具有特殊催化 功能的一类蛋白质。其特点：催化效率高专一性强反应条件温和催化活性受到调节和控制,目前，从生物界已发现2000多种酶。其中：工业用酶约5060余种；治疗和诊断用酶120多种；试剂酶300多种；基因工程工具酶100多种。,一、药用酶的分类及应用（一
2、）促进消化酶类（二）消炎酶类（三）与治疗心脑血管疾病有关的酶类（四）抗肿瘤的酶类（五）与生物氧化还原电子传递有关的酶（六）其他药用酶,1、促进消化酶类,这类酶的作用是水解和消化食物中的成分，如蛋白质、糖类和脂类等。最早使用的医用酶，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等水解酶。目前已从微生物制的不仅能在胃中、同时也能在肠中促进消化的复合消化剂，内含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等。,2、消炎酶类,蛋白酶的消炎作用已为实验所证实，从而促进了蛋白酶作为消炎剂的开发。如临床上采用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝半袋没等治疗炎症和浮肿疾患，清除坏死组织等。消炎酶一般做成肠溶性片剂。,3、溶血纤维蛋白酶类
3、,这类酶的作用是防止血小板凝集、阻止血纤维蛋白形成或促进其溶解。已应用于临床的主要有链激酶、尿激酶、纤溶酶、凝血酶等。,4、抗肿瘤酶,能治疗某些肿瘤，如L-天冬酰胺酶可用于治疗白血病。谷氨酰胺酶、精氨酸酶、丝氨酸脱水酶、苯丙氨酸氨解酶和亮氨酸脱氢酶等也具有抗肿瘤活性。,5、其他药用酶,如青霉素酶能分解青霉素，可应用于治疗青霉素引起的过敏反应超氧化物歧化酶可消除超养负离子、防止脂质过氧化，在抗衰老、抗辐射、消炎等方面有显著疗效葡聚糖酶和右旋糖酐酶能预防龋齿等,一.酶类药物的原料来源,(一)原料选择 选料应注意一下几点:(1)不同酶的原料选择(2)注意不同生长发育情况及营养状况(3)从原料来源是否
4、丰富考虑(4)从简化提纯步骤着手(5)如用动物组织做材料,则此动物宰杀后应 立即取材,一.酶类药物的原料来源,(二)微生物酶制剂高产菌株的选育 优良菌种的获得有三条途径:1.从自然界分离筛选;2.用物理或化学方法处理,诱变;3.用基因重组与细胞融合技术;,一.酶类药物的原料来源,(三)微生物酶制剂生产的发酵技术 首先要合理选择培养方法,培养基,培养温度,PH和通气量等,在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件,如培养基的灭菌方式,种子培养条件等.还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺,这些条件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益.,返回目录,二.酶类药物的提取和纯化,(一)生物材料的预处理 1.动
5、物材料的预处理(1)机械处理 用绞肉机将事先切成的组织绞碎.(2)反复冻融 冻到-10度左右,在缓慢溶解至室温,如此反 复多次.(3)丙酮粉 组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉,可在低温下保存 几年.,二.酶类药物的提取和纯化,2.微生物的预处理 要是酶是胞外酶,则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附取酶.但对胞内酶则需破壁,制成无细胞的悬液后再行提取.通常用离心或压滤的方法取得菌体,用生理盐水洗涤后除去培养基后,应深冻保存,有时为了大量保存或有利于提取,可采用干燥法.因为干燥法能导致细胞自溶,增加酶的释放,从而在后处理中破壁不必太剧烈就能到达预期目的.,二.酶类药物的提取和纯化,(1)干燥法 空气
6、干燥 特别适合于酵母,当其中由于喷雾干燥法的温度较高,对热稳定性差的酶不适用.真空干燥 此法对细菌特别适用.对敏感性的酶,应加入少量还原剂保护酶.冷冻干燥 对较敏感的酶宜用此法.,二.酶类药物的提取和纯化,(2)机械法 常用的方法有研磨法,组织匀浆法,超声波法,高速匀浆法等.(3)酶法处理 用的最多的是溶菌酶,也可用脱氧核糖核酸酶处理,二.酶类药物的提取和纯化,(二)酶的提取 提取方法主要有水溶液法,有机溶剂法和表面活性剂法 1.水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取.为了防止提取过程中酶活力降低,一般在低温下操作,但对耐高温的酶,应提高温度,是杂蛋白变性,以利于酶的提取纯化.,二.酶类药物的提取
7、和纯化,PH的选择对提取也很重要,应考虑:1.酶的稳定性;2.酶的溶解度;3.酶与其他物质结合的性质.选PH的总原则是:在酶稳定的ph范围内,选择偏高等电点的适当ph.一般来说,碱性蛋白酶用酸性溶液提取,酸性蛋白酶用碱性溶液提取;提取时加少量盐可提高酶的溶解度.,二.酶类药物的提取和纯化,2.有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶,由于和脂质牢固结合,用水溶液很难提取,为此必须除去结合的脂质,且不能使酶变性,最常用的有机溶剂是丁醇.丁醇具有亲脂性和亲水性,在脂与水分子间起类似去垢剂的桥梁作用.,二.酶类药物的提取和纯化,3.表面活性剂 表面活性剂有亲水性或疏水性的原子基团.有阳离子型,阴
8、离子型和非离子型的.表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中,故可用于提取结合酶,但此法用得较少.,二.酶类药物的提取和纯化,4.酶分离和纯化工作中的注意事项(1)防止酶蛋白变性(2)防止辅因子的流失(3)防止酶被蛋白水解酶降解,返回目录,三.重要酶类药物的制备,(一)药用酶类的概述(二)重要酶类药物 1.胃蛋白酶 2.胰蛋白酶 3.尿激酶 4.溶菌酶 5.L-天门冬酰胺酶 6.超氧化物歧化酶（SOD）7.细胞色素C 8.弹性蛋白酶 9.激肽释放酶,1.胃蛋白酶,广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃液粘膜中提取。pI1.0，最适pH1.52.0，最适温度37-40。
9、,药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。外观为淡黄色粉末，有肉类特殊气味及微酸味。,返回目录,1.胃蛋白酶,胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物，尤其对两个相邻芳香族氨基酸（苯丙、酪、色）构成的肽键最为敏感。对蛋白质水解不彻底，产物有胨、肽和氨基酸的混合物。临床上主要用于因食蛋白性食物过多所致消化不良及病后恢复期消化机能减退等。与碱性药物配伍会降低效果。,1.胃蛋白酶生产工艺,工艺路线,1.胃蛋白酶结晶胃蛋白酶的制备,药用胃蛋白酶原粉，20%酒精溶解。调pH3.0。5静置20h后过滤，硫酸镁盐析。盐析物在乙醇中溶解,过滤，滤液用硫酸调pH
10、至1.82.0，即析出针状蛋白酶。制剂：含糖胃蛋白酶。系胃蛋白酶用乳糖、葡萄糖或蔗糖稀释制得。,2.胰蛋白酶,从牛、羊、猪胰脏提取、结晶的冻干制剂，易溶于水，pI10.1。在酸溶液中稳定，在碱溶液中加热则变性沉淀。Ca2+有保护和激活作用。,牛胰蛋白酶原有229个氨基酸组成，含6对二硫键，在肠激酶或自身催化下，释放出6肽，变成有活性的胰蛋白酶。,返回目录,2.胰蛋白酶胰蛋白酶原激活示意图,2.胰蛋白酶,牛胰蛋白酶分子量24000，由223个氨基酸残基组成。胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组成的肽键。胰蛋白酶属丝氨酸蛋白水解酶。酶本身很容易自溶，降解为拟胰蛋白酶，乃至碎片，活力
11、逐渐下降或丧失。胰蛋白酶临床用于抗菌消炎，还用于治疗毒蛇咬伤。也是一个重要的工具酶。,2.胰蛋白酶生产工艺,3.尿激酶,是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。有多种分子量形式，主要有31300、54700两种（低分子尿激酶（L-UK）、高分子尿激酶（H-UK）。,H-UK溶解血栓能力高于L-UK。尿激酶的pI为pH8-9,主要部分在pH8.6左右。,返回目录,3.尿激酶,尿激酶具有溶解血栓的作用，已广泛应用于治疗各种血栓形成或血栓梗塞等疾病。尿激酶激活纤维蛋白溶酶原转化为纤维蛋白溶酶，纤溶酶具有较强的蛋白水解酶的能力，而纤维蛋白原在凝血酶作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块
12、在纤维蛋白酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。,3.尿激酶工艺路线：,3.尿激酶讨论：,1.采集的原尿要加防腐剂，恶臭尿不能用，尿液必须在10 以下尽快处理，防止产生热原和破坏酶。血尿和女性尿常含有红细胞等成分，影响收率和质量，故不能用。2.H-UK的溶解血栓的效果比L-UK的约高1倍，生产过程中pH就不宜太低，防止酶的降解。在低蛋白浓度、低离子强度、无稳定剂及环境温度较高时，均易引起酶的失活。3.防止UK成品中含有热原，主要措施是在制备的全过程特别是在精制中，需半无菌和无菌操作，提高成品的合格率。,3.尿激酶讨论：,4.尿中含有的盐的浓度及其杂蛋白，会影响UK的吸附，尿中的某些蛋白酶能水解UK
13、，这是提取过程中失活的重要原因之一。5.除使用硅藻土吸附外，还有以纤维素、离子交换剂、分子筛等为吸附剂，另外还有利用亲和层析法分离纯化UK，其收率很高。6.可利用右旋糖酐、聚乙烯二醇来稳定UK。延长其半衰期，提高稳定性。,3.尿激酶讨论：,7.从尿液中提取UK，由于尿液存在肝炎病毒、艾滋病毒等污染的可能，因而制备中要考虑灭毒，而美国已禁止用尿液为原料生产药物制剂。美国目前采用的是用人胎儿肾细胞培养，即组织培养法。在空间卫星上分离出专门产生UK的细胞并进行UK的结晶工作，含量比一般提高100倍。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）,溶菌酶全称为1，4-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。
14、溶菌酶是由129个氨基酸组成的单一肽链，它是一种小分子碱性蛋白，它在机体中起非特异防御机制，是一种有效的抗菌剂。,返回目录,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）,溶菌酶可通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌，它能切断肽聚糖中-1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。有些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，也会受到溶菌酶的破坏。人和动物细胞无细胞壁结构也都没有肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）,溶菌酶存在于自然界大多数动物、植物和微生物中。人们主要从鸡蛋清中提取此酶。溶菌酶溶于水，不溶于丙酮、乙醚，无臭、味甜。pI为10
15、.5-11.0，分子量14 000-15 000。酶的结晶形状随结晶条件而异。鸡蛋清溶菌酶非常稳定，耐热、耐干燥、室温下可长期稳定。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）生产工艺2,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）应用,1.在食品中的应用溶菌酶在人乳中含量相当高。溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白。所以溶菌酶是婴儿食品、婴儿配方奶粉、饮料等良好的添加剂。溶菌酶添加牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。因为卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂如苯甲酸，以达到保存食物的目的。可用于肉制品、糕点、海产品、饮料等的保鲜、防腐,利用溶菌酶
16、保鲜杨梅的实验左：溶菌酶组；右：对照组。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）应用,2.在医药临床中的应用溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，有抗菌、抗病毒、止血、消肿、镇痛、加快组织修复等功能，还有增强免疫力、激活血小板的功能，且对人体无任何毒副作用，具有良好的医疗效果和广阔的应用前景。临床上，溶菌酶适用于五官科各种炎症，亦用于治疗扁平疣、传染性软疣、寻常性疣、尖锐湿疣等多种皮肤病。此外,可用溶菌酶来制眼药水、润喉液等,因此溶菌酶是一种较为理想的药用酶。另外，临床上还把人体溶菌酶的浓度作为多种疾病的诊断标准。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）应用,3.在生物工程中的应用溶菌酶是生物工程
17、中必不可少的工具酶。一般应用溶菌酶进行菌体或细胞破壁提取细胞内容物（如原生质体等）应用于融合育种，或生产蛋白质、核酸类呈味物质。在环境工程中也用溶菌酶处理污水、污泥。,5.L-天门冬酰胺酶,L-天门冬酰胺酶是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，白色粉末，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚和甲醇。最适pH8.5，最适温度37。,返回目录,5.L-天门冬酰胺酶,最早是从1953年从豚鼠血清中发现的，为酰胺基水解酶，专一地催化天冬酰胺水解形成L-天门冬氨酸和氨，肿瘤细胞本身不能合成天冬酰胺，需依赖宿主供给，外源性天冬酰胺酶能使血液中天冬酰胺分解成天冬氨酸，从而使肿瘤细胞缺乏天冬酰胺而不能合成蛋
18、白质，从而达到抗肿瘤目的，主要用于治疗白血病。,5.L-天门冬酰胺酶生产工艺,5.L-天门冬酰胺酶工艺过程,菌种培养：大肠杆菌A.S.1.375，普通牛肉培养基，接种后于37培养24h。种子培养：16%玉米浆，接种量1%1.5%，37，通气搅拌培养48h。发酵：玉米浆培养基，接种量8%，37通气搅拌培养68h。,5.L-天门冬酰胺酶工艺过程,菌体干粉制备：离心分离发酵液，得菌体，加2倍量丙酮搅拌，压滤,滤饼过滤，自然风干成菌体干粉。提取、沉淀、热处理：每千克菌体干粉加0.01mol/L的pH8的硼酸缓冲液10L，37保温搅拌1.5h，降温到30以后，用5mol/l HAc调节pH4.24.4，
19、进行压滤，滤液中加入2倍体积的丙酮，放置34h。过滤、收集沉淀、自然风干，即得干粗酶。精制、冻干,6.超氧化物歧化酶（SOD）,是一种重要的氧自由基清除剂，催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2：机体内存在一套解毒系统，从而保护机体免受损伤,返回目录,6.超氧化物歧化酶（SOD）,SOD属金属酶，按金属离子种类不同：分为Cu、Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。Cu、Zu型存在真核细胞。Fe型存在于原核细胞。Mn型存在于真核和原核细胞中。除了动物、微生物有SOD，植物也有SOD。哺乳动物中的SOD主要分布在肝、肺、肾、红血球等器官和组织。SOD在体内血中半衰期为69min,6.超氧化物
20、歧化酶（SOD）结构,对Cu、Zu-SOD研究的比较多，Cu和Zn与必需基团His(组)形成咪唑桥。Cu与4个His及1个H2O配位，Zu与3个His和1个Asp（门冬）配位，构成活性中心。,6.超氧化物歧化酶（SOD）结构,6.超氧化物歧化酶（SOD）,实验表明，Cu与Zn的作用是不同的，Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关，而Cu与催化活性有关，透析去除Cu则酶活性全部丧失。Cu、Zn-SOD分子量为32000，由153个氨基酸组成，由二个亚基组成。对pH,热比较稳定。人的Cu、Zn-SOD的遗传基因在第21条染色体上。,6.超氧化物歧化酶（SOD）生产工艺,6.超氧化物歧化酶（SOD）应用,（1）治疗用药（炎症、辐射病、自身免疫性疾病、癌症等）。（2）临床检测；（3）药物筛选（用于抗衰老、抗癌药物的筛选）（4）其他（化妆品等）。,
