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1、高通量药物筛选与创新药物研究,内容,高通量药物筛选：模型建立、化合物制备、自动化、数据处理我国高通量药物筛选的现状我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略：组合筛选模型体系、分子家族筛选模型体系、化学生物学方法研究活性化合物作用机制我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例,化合物资源,药物发现DRUG DISCOVERY,药物开发DRUG DEVELOPMENT,1.临床前研究2.临床研究,药物候选化合物,1.药物先导化合物的发现2.药物先导化合物的结构优化,新药研究的两个阶段,分子生物学细胞生物学基因组学蛋白组学,生物信息学结构生物学计算机辅助药物设计药物化学,高通量筛选技术,天
2、然产物化学合成组合化学,化合物库,筛选模型,结构优化,先导化合物,筛选,药物发现的关键环节高新技术集中的焦点,高通量筛选（HTS）,运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选。,The Evolution of HTS,高通量筛选,快速-每天筛选上万药次微量-筛选样品需要量为微克级灵敏-准确判断筛选样品的活性和选择性经济-筛选费用低,常规筛选,高通量筛选,常规筛选和高通量筛选,高通量筛选的四个要素,样品制备,自动化,HTS,模型建立,数据处理,要素一：高通量筛选模型建立,针对某一特定
3、靶点，设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选。,选择高通量筛选的靶点,来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。,Current Drug Targets,Membrane Receptors45%Enzymes28%Hormones and Factors11%Ion Channels5%DNA2%Nuclear Receptors2%Unknown7%N=483 J.Drews,Science(2000)287:1962,靶点确证,Expressio
4、n phenotype?Mutant?Antisense treatment?Antibody treatment?RNAi?Knockout/knockin?Inhibitor treatment?,克隆PCR、RT-PCR方法从cDNA文库、EST克隆、组织和细胞的总RNA中得到关键靶基因,亚克隆大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫表达系统,大规模表达、纯化、复性，得到纯净重组蛋白,时间,光吸收,E412nm=13,600 M-1cm-1,检测方法的确定、优化及高通量筛选模型的建立,分子水平筛选模型建立流程,模型设计,体外生化检测通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、受体、蛋白与蛋白的
5、相互作用等细胞水平的检测主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测技术测量生物反应的终点。,体外生化检测,显色反应(Photometry),显色反应方法检测MetAP活性,显色反应方法检测MetAP活性,荧光强度(Fluorescence Intensity),7-amino-4-methylcoumarin,rhodamine 110,resorufin,Fluorogenic Peptide Substrate,荧光偏振(Fluorescence Polarization),FP,Theoretical FP
6、 Behavior of a Series of Fluorescent DyesAs a Function of MW,尺寸变化,IMAP,Protein-DNA Binding FP HTS,Ser/Th Kinase Competitive FP Assay,荧光共振能转移(FRET),荧光共振能转移是指供体受激发后不发射出光子而将激发的能量转移到受体的现象。这种方法可检测生理状态下相互作用分子间的距离。产生FRET需要满足三个条件：供体和受体间距离接近（10100埃）；供体的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠；供体和受体之间迁移偶极子的方向必须平行。,Fluorescence Reso
7、nance Energy Transfer(FRET),Donor,Acceptor,荧光共振能转移,在大多数情况下，供体与受体标记的荧光染料是不同的，供体的荧光会因为受体的存在而发生淬灭。一般荧光素和四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）之间发生50%有效能量转移所需距离为55 埃，EDANS和DABCYL之间为33埃，EDANS和荧光素之间为46埃。FRET主要用于淬灭分析或与淬灭相关的分析。,Fluorogenic(Quenched)Substrate,FRET,Example of use of FRET in a protease assayMatayoshi et
8、 al.,Science 247 954(1990),时间分辨荧光共振能传递（Time Resolved FRET）,LANCE Assay for Kinase,LANCE Assay for Transferase and Nuclear receptor,LANCE Assay for Protease and Helicase,AlphaScreen,AlphaScreen for PIP3,AlphaScreen for cAMP,BRET,闪烁亲近检测法(Scintillation Proximity Assay,SPA),FlashPlate-SPA without Beads,
9、Bind ReceptorOr Target toPlate,RadiolabeledTracer andSample added,Only boundTracer isMeasured,常用的蛋白水解酶检测方法,常用的蛋白水解酶检测方法,常用的激酶检测方法,常用的磷酸酯酶检测方法,以酶为靶点,以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几个步骤：确定反应条件（如缓冲液、pH、温度）天然或合成的底物的确定酶动力学信号窗口的评价对已知抑制剂的反应情况底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和解旋酶。
10、,细胞水平检测,荧光成像检测(FLIPR),贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用96孔或384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。,FLIPR functional screening assay,L,GTP,GDP,PLC,inositol phosphates,Ca2+,Fluorescentdye,+,fluorescent signal,报告基因,报告基因受一个可诱导转录因子的调控，从而响应受体的活动，并指导报告蛋白的合成。对应不同的细胞株，可有多种报告基因和载体可供选择。常用的有萤火
11、虫荧光素酶(luciferase)、分泌型碱性磷酸酯酶(secreted alakaline phosphatase,SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramiphenicol acetyltransferase,CAT)、-半乳糖苷酶(-galactosidase)、-内酰胺酶和绿色荧光蛋白(GFP)。,Reporter Gene,BaitProtein,BindingDomain,Prey Protein,ActivationDomain,Two hybrid proteins are generated with transcription factor domainsBoth fu
12、sions are expressed in a yeast cell that carries a reporter gene whose expression is under the control of binding sites for the DNA-binding domain,The Two-Hybrid System,Reporter Gene,BaitProtein,BindingDomain,Prey Protein,ActivationDomain,Reporter mRNA,Reporter mRNA,Reporter mRNA,Reporter mRNA,Repor
13、ter mRNA,The Two-Hybrid System,Interaction of bait and prey proteins localizes the activation domain to the reporter gene,thus activating transcription.Since the reporter gene typically codes for a survival factor,yeast colonies will grow only when an interaction occurs.,Quantum dots,Invitrogen 公司的Q
14、dot技术Quantum dots 是一种与蛋白质尺寸相当的半导体材料，具有独特的荧光特性。已成为筛选药物的有利工具。荧光持续时间时间长，适合时间分辨检测。颜色多样，在同一激发波下，不同尺寸的微利可发出多种激发光，加上其表面可以耦联多种生物分子，可同时标记多个靶点。安全：细胞毒性低，可用于活细胞或者体内研究。,Qdot的结构,High Content Screening,High Content Screening,CellomicsArrayScanKineticScan Molecular DevicesDiscovery-1,Visualize and analyze cell popu
15、lationsIdentify sub-cellular protein localizationPerform multi-parameter analysis,Live cell assays to detect translocation of signaling proteins:primary screeninglead profilingPathway screening for functional effect,rather than specific mode of action(e.g.:in vitro binding,catalytic activity).Modula
16、tion of protein translocation is an alternative to inhibition of catalytic activity:protein translocation modulators.,Translocation Assay,Protein Translocation is Essential for Intracellular Signaling,The PKB/Akt Pathway,Greater Selectivity with Translocation Modulators,Active Site inhibitors often
17、lack specificity and selectivity unwanted side effects.Many signalling proteins with very different functions share similar active sites-e.g.Protein Kinase C family.,ATP and Substrate binding sites,X,X,X,PKC catalytic inhibitors all act on ATP-binding site,Other binding sites could be targets for sp
18、ecific,selective inhibitors.,GFP Fusion Proteins for Detecting Translocations,Make stable,transfected cell lines.Quantify intracellular translocations of target in high throughput.,Membrane to Cytoplasm Translocation,Target:PLC-PH domainHost cell type:CHO-hIRStimulation:ATPTimescale:5-20 sec,Cytopla
19、sm to Nucleus Translocation,Target:Erk1Host cell type:HeLaStimulation:FCS/hEGFTimescale:10 min,Vesicle to Plasma Membrane Translocation,Target:GLUT4Host cell type:CHO-hIRStimulation:InsulinTimescale:20 min,A human GLUT4 assay in Xcellsyz Ltd.conditionally immortalized human fat and muscle cell lines
20、 is under development.,Cytoplasm to Membrane Translocation,Target:Akt1/PKBaHost cell type:CHO-hIRStimulation:IGF-1/insulinTimescale:5 min,Assay read on IN Cell Analyzer with the Membrane Spot Analysis Module(MSPO).,要素二：化合物样品库制备,结构多样性（Chemical diversity）类药性（Drug-like),Lipinski规则,MW 500ClogP 5H bond d
21、onors 5H bond acceptors 10,Properties of an“Average”Drug,Undesirable Compounds,UnstableReactiveMichael acceptorToxicLiquidGeneral metal chelatorPolyaromaticmetallocompound,筛选样品来源,传统化学合成、分离合成化合物分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位组合化学合成从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物库与其他机构的合作、交换或购买,传统化学合成和分离,单个合成、分步纯化 一个化学工作者一年合成化合物的数量从不足一百
22、个特点：数量相对较少，但各化合物相关数据全，质量较高对特定的靶点SAR明确，对一个全新靶点，这些知识有助于产生新的先导化合物,组合化学,通过各反应单体之间的不同组合方式，在短时间内生成大量的化合物（纯的单一化合物或单一化合物的混合物）供医药研究或其他用途。如图示：,特点：化合物数量大，相对结构多样性易于设计、合成-100,000 compounds(and more!)in a year with a few chemists and automationSAR的产生Drug-like？,组合化学,发掘天然产物资源,大自然是另外一个能提供具有结构多样性小分子有机化合物的主要来源。经典方法-分离
23、纯化、结构鉴定、活性测试-费时、效率低，远远不能满足现代高通量筛选的需要。这在一定程度上影响了天然产物来源的样品在近年来的药物研究中受重视程度。从结构多样性的角度考虑，大自然可能给予我们的结构多样性大大高于组合化学，因而天然产物或天然来源的样品的重要性不容忽视。这也是现代天然产物化学研究的新的切入点。,天然化合物库（Nature Product Pool）,尽管许多天然产物在一些特定生物模型上被筛选过，但至今没有多少化合物在所有现存的模型上被广谱筛选过的事实似乎给我们这样一种信息：随着新的药物筛选模型的不断涌现，一些已知的天然化合物可能会被发现具有全新的生物活性。,天然产物对新药发现和开发的重
24、要性,天然产物，特别是植物中的天然产物作为药物用途的历史非常古老，为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？为什么最近制药企业又对来源于天然物的先导化合物产生了兴趣？,为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？,化学家和生物化学家对次级代谢产物（所有非蛋白天然产物）的产生提出了六种主要的假设，Haslam归纳如下：1）次级代谢产物是无特定生理功能的单纯排泄物；2）次级代谢产物曾经起过功能代谢作用，但目前其作用已失去；3）次级代谢产物是所有体内变化的产物，在生物体内没有任何真正的作用；4）次级代谢产物是进化过程中的一例，在新化合物产生之前，次级代谢
25、物是为了保存进化所必需的物质而存在；5）次级代谢产物为初级代谢所不需要的酶提供发挥作用的场所，重要的是次级代谢过程，而不是次级代谢产物；6）次级代谢能产生防御物质和其他重要的生理活性物质，对生物体的生存具有重要作用。,为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？,20世纪70年代末兴起的组合化学的发展使得短期有效合成上万个化合物成为可能；随着具有自动化系统的高通量筛选技术的发展，每天可以筛选50000个以上的样品，为组合化学合成的样品提供一种快速筛选方法；天然生理活性物质分离的复杂化和大量生物材料获得不易。,天然产物研究的复活,天然产物研究的成功天然产物研究的独特性新筛选方法的影响,根
26、据新药的研发过程设计有效的天然产物研究方法,天然材料的获得和提取有效的筛选方法天然生理活性物质的分离快速有效的结构解析方法生物学的评价天然生理活性物质的大量获得构效关系研究,天然产物或其类似物作为药品实例,61%of 877 small molecule drugs introduced worldwide during the period 1981-2002 can be traced to,or were inspired by,natural products.,洛伐他汀(Lovastatin)(HMG-CoA抑制剂）,Compactin:R1=R2=HMevinolin:R1=CH3
27、,R2=HSimvastin:R1=CH3,R2=CH3,Pravastatin,Fluvastatin,Cerivastin,Atorvastin,环孢菌素A（Cyclosporine A）,真菌Trichoderma polysporum分离,抑制器官移植排异反应的免疫抑制剂,紫杉醇,紫杉醇(1,Paclitaxel,Taxol)是从太平洋红豆杉Taxus brevifolia树皮中提取分离得到的天然二萜化合物。多西紫杉醇(2,Docetaxel,Taxotere)是在紫杉醇的结构修饰和改造过程中通过半合成方法得到的。2001年全世界紫杉醇年销售额在20亿美元以上，多西紫杉醇年销售额达到1
28、0亿美元以上。这两种药物已经成为当前，也是历史上最为畅销的抗癌药物。,喜树碱及其衍生物,Camptothecin R1=R2=R3=HTopotecan R1=H,R2=CH2N(CH3)2,R3=OHIrinotecan R1=CH2CH3,R2=H,R3=(A)9-Aminocamptothecin R1=R3=H,R2=NH29-Nitrocamptothecin R1=R3=H,R2=NO2,(A),喜树碱及其衍生物是DNA局所异构酶(DNA toposomerase 抑制剂。,吗啡生物碱,Morphine,R=HCodeine,R=CH3,Buprenorphone,活性为Morph
29、ine2550倍，成瘾性低于吗啡。,Pentazocine,活性仅为吗啡的30，但成瘾性极低,天然产物研究的未来,利用组合化学合成“非天然的天然物”或“类天然产物库”,多样性导向合成(diversity-oriented synthesis),Galanthamine 四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂及高尔基-质膜运输抑制剂Secramine A 的发现,Shair M D and Kirchhausen T.Nature chemical biology,2006,2:39-46,2527 compounds were synthesized,Compound Storage,Soli
30、dLong-term storageDMSO solutionLong-term storage(10 year?)Working solutions,Compound plates,Mother PlatesDMSO solutions from vendorsDaughter PlatesDMSO solutions1 mg/mlAssay PlatesAqueous solutions25 g/mL compound2.5%DMSO20 L,80 Compounds,352 Compounds,88 Compounds,Sample management technology,化合物库是
31、医药公司和研究机构最宝贵的资产。其数量和质量的重要性需要高可靠性的自动化储存和检索系统。专业的样品管理公司可提供整套的样品管理产品，包括：自动化的储存系统大型系统可储存60,000,000样品。储存环境温度可达到-80。自动化样品处理设备样品称量、溶解，微孔板间复制，封膜，Cherry picking。软件储存系统控制软件，样品管理系统软件。耗材微孔板，微试管，封膜，Barcode.,Sample management technology,瑞士Tecan公司的样品自动化储存系统产品,Click to view the video,REMP Large-size storeTM(LSS),要素
32、三：自动化,自动化技术的应用，提高筛选效率，摆脱人为误差因素,微孔板（Microplate）,微孔板（Microplate）是许多方法和解决方案的最终决定因素。尽管近年来的芯片技术发展很快，但微孔板在生物医药研究中仍扮演着不可替代的角色。正是微孔板的应用使人们提出了将多个反应管以平行方式同时处理的概念，这些概念一定程度上大大促进了自动化筛选系统和工作站的快速发展。对于所有开发的仪器而言，微孔板是一个共同的标准，同时标准化的要求也增加了现代自动化系统的可靠性。其中，96孔板和384孔板都已经制定了相应的标准(Society of Biomolecular Screening task force
33、 Standards in Automation and instrumentation)。但是其他的高密度板，如864、1536、3456，甚至9600孔板目前还没有统一的标准。这些标准或准标准板的使用已经大大地降低了筛选成本，同时增加了通量。,Microplates,微孔板是筛选的载体，其制造技术也随着筛选技术的发展而发展，包括：微孔板的颜色和材料微孔板微孔的设计和密度微孔板材料的表面处理,Microplates from Corning,Matrix of Wells,864,96,384,1536,WellRowColumnVolume9681230038416241001536324
34、810,Microplates,微孔板的颜色和材料,Microplates,微孔板微孔的设计和密度微孔板微孔密度的增加可以显著提高单位时间内筛选的通量。节约成本。提高筛选质量。,Microplates,微孔板材料的表面处理,微孔板设备,一般而言，一个自动化筛选系统的大多数组件总是围绕微孔板而工作的，它们均可称为微孔板设备。独立单元（Stand-alone）：指象洗板器、液体分配器（Liquid Dispenser）和酶标仪等工作站（Workstation）：能执行多重功能（通常指围绕微孔板）的部分，如液体转移装置（Liquid Handling）可围绕微孔板执行多重功能,History 198
35、0s,Zymark,世界上第一台工作站是由Zymark公司开发的BenchmateTM系统，它集成了精密天平、单通道加液头、移液装置、振荡器和HPLC进样器等。通过一个机械臂可以将不同的容器从一个工作台移至另一个工作台，但这一系统主要是针对管形反应器设计而设计的，并不适用于今天的微孔板。,第一台基于于微孔板设计的工作站是由Beckman Coulter开发的Biomek1000，它整合了单通道和多通道的吸液、加液、洗涤和单通道检测（密度测定）等组件部分。Biomek2000：使用可变换工具后变得更加灵活，如不同的吸收器、分配器等。其特点是可以针对不同的需要设计不同的操作程序。BiomekFX：
36、集成了更强大的功能，如多通道可同时、亦可执行不同的任务，双手臂操作则更是增加了有效性和操作速度。,Biomek 2000 Automation Workstation,自动化液体分配装置,Beckman Biomek FX,96-channel pipetting head High-capacity for simultaneous liquid transferSpan-8 pipettor Flexible with individual movement and liquid sensing capability for hit picking and plate reformatti
37、ng,检测系统,UV-visible Light AbsorbanceFluorescenceFluorescence IntensityTime-resolved Fluorescence(TRF)Fluorescence Polarization(FP)LuminescenceRadioactivity,Microplate Readers,SpectraMax Plus 384 UV absorbanceContinuous 190-1000 nm,Reads 96 wells,5 sec;384 wells,16 sec,SpectraMax Gemini XS Luminescenc
38、e,fluorescence and time-resolved fluorescenceContinuous 250-850 nmRead 96 wells,27 sec;384 wells,2 min 30 sec,VICTOR2 V Multi-label Reader,Filter-based instrumentFive technologies:Absorbance LuminescenceFluorescenceTime-resolved fluorescenceFluorescence polarization,Microplate reader,最新的微孔板检测器具备高速，高
39、灵敏度，通用的特点。PerkinElmer公司的EnVision 检测器可以在36s内完成对一块1536孔板的荧光强度检测。整合了光吸收，荧光强度，荧光偏振，时间分辨荧光，化学发光，激光等多种检测手段。,EnVision(PERKINELMER),Safire(TECAN),SpectraMax M5(Molecular Devices),自动化系统(Automated Robotic System),自动化系统是指集独立单元、工作站于一个特定的功能环境，由一种总系统软件控制，由一至二个机械臂完成微孔板在独立单元和工作站之间的转移工作。可重复编程的机械装置系统，能自动重复完成包括自动称量、液体
40、转移、分离、仪器硬件的转移等。,自动化系统的组成,机器人控制器机械手伺服轨道外围设备微孔板设备：液体转移装置，培养箱，洗板器、液体分配器和酶标仪等,机器人类型,（关节机器人）Articulated arm robots（圆柱坐标机器人）Cylindrical coordinate robots（高架机器人）Overhead gantry robots,关节机器人（Articulated arm robots ORCA Robot）,圆柱坐标机器人（Cylindrical coordinate robots SEICO Robot）,（高架机器人）Overhead gantry robots,机械手（Gripper）,线形伺服轨道（Linear servo track）,机器人通常被安装到线形伺服轨道上，使它可以移动到桌面的其他位置。如前所述，这一点极大增加了机器人的有效工作空间，并使它在无人力干预的情况下为更多的仪器服务。,典型的外围设备（Typical peripheral devices）,微孔板存放装置（Microplate storage unit）条形码识别器（Bar code scanner）液体转移（Liquid transfer）培养箱（incubator）,Microplate storage unit,stacker,carousel,ORCASystem,
