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1、活体生物体内成像技术In Vivo Imagine Technology,国家生物医学分析中心,活体生物体内检验是生物研究的最终验证,体外试验（In Vitro）分子生物学技术 克隆技术 蛋白组学 等等,活体生物体内成像（In Vivo Imaging Technology）,目前的活体生物体内成像技术和方向,超声（Ultrasound）,计算机断层摄影（Computed Tomography，CT）,核磁共振（Magnetic Resonance Imaging，MRI）,正电子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET）,单光子衍射(Single-Photo
2、n-Emission Computed Tomography,SPECT),可见光及荧光成像(Optical Imaging with visible light and Fluorescence）-生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）,几种常用活体体内成像技术的比较,结构成像,功能成像,操作复杂,操作简单,MRI核磁共振,Optical Imaging可见光成像,PET/SPET正电子衍射,Ultrasound超声,CT,活体成像系统-专门为检测活体动物体内发光而设计的技术,生物体内成像系统使研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。,理想
3、的光源：萤火虫或细菌荧光素酶（luciferase）,基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。,精诺真活体成像系统原理,遗传学标记实时、原位多波长检测,基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术,将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选,培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。,荧光素酶的表达（1）,荧光素酶的底物荧光素，为约280道尔顿的小分子。荧光素脂溶性非常好,很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，先进的成像系统，
4、应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可观测并记录到这些光子。,Luciferin,荧光素酶的表达（2）：细菌荧光素酶（Photorhabdus luminescens）,活体成像系统,Living Image 成像及数据分析软件,IVIS50 Imaging System,在波长大于600nm时，由老鼠体内发出的光是可以穿透皮肤被检测到。,标准图像的组成,当前肿瘤研究的主要方法还主要局限于肉眼观察、处死老鼠后的肿瘤体积测量、称重及组织学切片观察等。,传统肿瘤模型,传统实验方法与活体成像方法比较,结果显示：肿瘤的大体积与生物发光强度呈线性相关,Brian Ross,P
5、h.D.University of Michigan Medical center.,核磁共振与活体成像技术比较,精诺真具有高度灵敏性,Images courtesy of Contag et al,Stanford University,活体成像技术的主要应用,免疫学、代谢、发育、内分泌学，等等,B16-F10 luc+肿瘤细胞尾部静脉注射后2分钟的成像,Oncology Applications 癌症研究的应用,体内药物分析的生物发光检测,1x106，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射,14天,21天,28天,35天,处理方式 细胞数,无治疗对照 2.2x109,5-FU治疗 2.8x1
6、08,丝裂酶素治疗3.6x106,小鼠#6 n=7,小鼠#40 n=8(从第11天开始给药),小鼠#31 n=8(从第11天开始给药),静脉注射治疗起始点,Exp#049,雄性SCID小鼠,对照 n=5-8,丝裂酶素C n=4-8,5-FU n=8(5-氟尿嘧啶),实验天数,生物发光数,检测体内药物治疗,1x106，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射,对照组于第五周结束观察,n=13,n=6/7,生物发光强度,Exp#081 雄性nu/nu CR n=13,5,7,生物发光检测体内药物治疗的复发作用,5x105，PC3M-Luc-C6肿瘤细胞，原位前列腺癌模型,1周,3周,5周,7周,8周,
7、生理盐水对照组（小鼠#40）静注，3次/周，第二、三周,5-Fu治疗组(小鼠#38)100 mg/kg 静注，1次/周，第二、三、四周,丝裂酶素治疗组（小鼠#4）2mg/kg 静注，3次/周，第二、三周,组织病理学观察,第20天,实验性骨转移瘤模型,皮下注射PC-3M-Luc,Virology Applications细菌及病毒学研究应用,以及在以DNA为基础的基因治疗研究的应用,不同肺炎链球菌菌株感染模式研究,Orihuela CJ,St.Jude Childrens Research Hospital,Scand J Infect Dis.,2003,.,单纯疱疹病毒(HSV)在 干扰素(
8、IFN)受体敲除小鼠的感染实验,Luker et al,Washington University School of Medicine,J.Virol.,2003,siRNA 阻断RNA 研究的应用,当共转染 pGL3-luc 或HCV-luc 表达载体特异的 siRNA时，可抑制报告基因Luciferase的表达,McCaffrey et al,Stanford University School of Medicine,Nature,2002,Stem Cell Research干细胞研究的应用,研究干细胞造血作用,Cao et al,Stanford University School
9、 of Medicine,PNAS,2004,活体内蛋白质-蛋白质之间的相互作用,LUC N端 与 C端 分开时并不发光蛋白质A 与蛋白质B 分别与LUC N端 和 C端 连接两组蛋白质由不同的质粒诱导表达,发光,+,Paulmurugan,et al,University of California,PNAS,2002,R.Paulmurugan,et al,University of California,PNAS,2002,活体动物体内观察细胞凋亡,Laxman et al,University of Michigan Medical School,PNAS 2002,TRAIL激活Ca
10、spase 3的体内成像,Laxman et al,University of Michigan Medical School,PNAS 2002,Transgenic Animal Model(LPTATM Animal)转基因动物模型的应用,基因激活 表达 生物发光,研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断靶基因是否表达，既基因的“开”“关”现象。,转基因动物模型原理,生物大分子合成,血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）是VEGF的同源受体，VEGF在血管生成过程中分泌。Vegfr2-luc转基因小鼠应用从小鼠VEGFR2基因启动子及内皮细胞特异的增强子共4.5kb，以驱动荧光素酶表
11、达。,转基因动物研究原理,通过观察发育过程中,VEGFR2-Luc转基因小鼠的VEGFR2表达逐渐降低,研究生物体的发育过程。,信号强度,Ning Zhang et al,Xenogen Corporation,BLOOD,2004,已知，VEGFR2启动子活性在肿瘤坏死区域的血管内皮细胞中可被上调。Vegfr2-luc报告基因的活性可在皮肤创伤治愈过程中被诱导及在肿瘤特异的新血管形成中有潜在功能。,VEGFR-2在伤口愈合过程中的诱导表达,三维成像表面以彩色显示荧光对数值,生物发光检测与荧光检测的比较,Bioluminescence,Fluorescence,107 cells PC3M-luc/DsRed,106 cells PC3M-luc/DsRed,Sig/bkg=2200,Sig/bkg=5,Sig/bkg=250,Sig/bkg 1,2107,2106,7107,2107,Min detection 102 cells,Min detection 106 cells,生物发光在体内检测的灵敏度远远高于荧光,利用精诺真技术，生物发光在体内检测的灵敏度可达到100个细胞,同样条件，荧光在体内只能最少检测到1,000,000个细胞,谢谢！,
