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1、手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输C一）粪便标本。采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4C暂存12小时内送达实验室，-20C以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70C冰箱。（二）咽拭子标本。采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带
2、有唯一识别号码的标签。4暂存并在12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。（三）血清标本。各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化,评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20以下冰箱中冷冻保存。（四）疱疹液。在手足口病的实验室诊断中
3、，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，一20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于一70C冰箱.（五）肛拭子标本。采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后，迅速将棉签放入装有3-5ml保存
4、液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。（六）尸检标本。采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。（七）脑脊液标本。出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为LO-2.0mL采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即（12h内）
5、送达实验室，一2OC以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于一70冰箱。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录,肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。二、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊
6、断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。标本保存液的配置见下表：保存液Eagle飞液（MEH）80.5ml3%L-谷氨酰胺20OmMI.Oml胎牛血清5.Oml7.5%NaHCoa溶液3.5ml青、链霉素IOml（各00D0Ul）三、实验室检测操作流程（一）病毒分离。1.试剂配置（
7、1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：生长液（GM）维而KMMJ92. 5ml1. OmlEagles液（MEM）86.5ml3%L-谷氨酰胺20OmM1.Oml胎牛血清10.Oml2.Oml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、链霉素LOml1.Oml(各IooOOU/ml)(2)粪便标本和肛拭子的处理液完全PBS液中加入P.S溶液,终浓度为青霉素100单位/ml,链霉素为100g/ml0完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。A液：试剂品名加入量NACL&OOgKCL0.20gNaHPO(无水)0.91gKHjPO10.12g用60080O
8、ml蒸偏水溶解以上盐类，加蒸用水补至1000ml,IOpsi(70Kpa)15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液(不含钙、镁离子)。B液：试剂品名加入量MgCI*6乩O0.IOg溶解于IoOml蒸僮水中，IOpsi(70Kpa)15分钟高压灭菌。C液：试剂品名加入量CaCl20+IOg溶解于100nlI蒸i水中,IOpsi(70Kpa)15分钟高压灭菌。2.病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒(如EV71、CVA16)生长。对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVAI6等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。HEP-2细胞，来源于人
9、喉癌上皮细胞。3.标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入IomlPBS、Ig玻璃珠、ImI氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于一20（；5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min;6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在150Og条件下离心20min;7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；8）1管粪便悬液冻存
10、于一2Ot作为备份，另1管存于4-8。C以备接种。（2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。（3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融）,使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4条件下，100OOrPm离心20min,用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。4.接种和观察(病毒分离)(1)通常使用8ml的斜面试管培养细胞,传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。显微镜下观察单
11、层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；(2)倒掉生长液(GM),换上1-1.2ml的维持液(MM)；(3)每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEP-2细胞，正确标记每支细胞培养管(包括标本的编号、日期、传代数):(4)每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；(5)每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36。(或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液(GM),每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液(MM)o同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。(6)使用倒置显微镜每天
12、观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应(CPE)的出现(如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等)；(7)记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE(I+4+)、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化(1+,25%；2+,25%-50%;3+,50%-75%;4+,75%-100%)；(8)如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化(3+CPE),然后储藏在一20以备二次传代；(9)第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后一2CTC或一70C冻存；(IO)一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保
13、存在-20C冰箱(二代病毒)。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；(11)如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。(注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代):(12)盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；(13)注意：如果接种后24h内出现CPE,很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取IoOUI阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐Ih后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；(14)几个概念：A：毒性反应：如果在接种后2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应
14、。这些已接种标本的试管应在-20C冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中(此时是第二代)。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在-20冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE,那么认为这个标本是阴性的。5.
15、病毒分离结果解释RD细胞支持HFMD的主要病原体CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制,CVAl6和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应(CPE),表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CVAI6和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CVAI6,表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVAl6早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPEo若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病
16、毒）。但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是，肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr株，CVAl6原型株
17、为G-IO株）或流行株，有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。使用对肠道病毒敏感的细胞，如RD细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的C液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，但分离株的滴度（100CCID5oO.05ml）要事先测定。中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现CPE,特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。1.液体配制A液：血清处理液：（10Oml中含下列试剂成
18、份）MEM85ml3%L-谷氨酰胺Iml7.5%碳酸氢钠2ml胎牛血清2ml青、链霉素（各IOoOOU/ml）IOmlB液：细胞营养液：（按生长液配方配制，10Oml中含下列试剂成份）MEM85ml3%L-谷氨酰胺Iml7.5%碳酸氢钠2mlHEPESIml胎牛血清IOml青、链霉素（各100OOU/ml）ImlC液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，10OnIl中含下列液体）MEM93ml3%L-谷氨酰胺InIl7.5%碳酸氢钠2mlHEPESIml胎牛血清2ml青、链霉素（各IoOoOU/ml）Iml2.攻击病毒CCIDSC滴定和滴度梯度制备（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4
19、、1200OrPnI条件下离心Iomin,取上清液分装于10支冻存管中，每管1.5ml,-般每管应在一次试验中用完，有剩余应高压后废弃；(2)加EagIe液10倍系列稀释为IOT至IOT病毒液，各加入细胞板内，每孔50l,每稀释度4孔细胞；(3)每孔加细胞悬液501,同时设细胞对照(50Ul稀释液+50UI细胞悬液)，36C培养7d,观察细胞病变；(4)按Behrens-Karber公式计算出分离病毒株的CCIDso;logCClb=LY(S-0.5),其中：1.=实验中使用的最低稀释度的对数值；d=稀释梯度的对数值；S=终判时阳性部分的总和(即出现CPE的细胞孔所占的比例之和)。(5)正式试
20、验前应先滴定攻击病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100CCID5。的病毒载量；(6)按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量(即100CCID500.05ml)；(7)取3支小试管，每只加病毒稀释液(液体配制中的C液)0.9ml；(8)用带滤芯的吸尖(ART吸尖)吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液(即100CClDO.05ml)到第一支小试管中，换另一支ART吸尖,轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1CCIDsoO.05ml和0.1CCID500.05mlO稀释好的己知涌度的病毒OInll(100CCID50005ml)病毒稀释液0.9m
21、l1010.1(CCID500.05ml)3.稀释血清（1）发病3d内采取患者急性期血清，发病后2-4周采取恢复期血清，分别冻存在-20C备检。（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml,加待测血清0.1ml,盖紧塞子，震摇混匀，放4C冰箱过夜，即为1:4稀释血清。次日56、30Inin灭活。（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml,每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取处理过的血清0.Iml加入第一孔（即为1：16）,吹吸870次，吸0.Iml加入第二孔（即为1:6
22、4）,依次至1：1024,血清稀释的过程中不必更换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024o（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。4.病毒中和抗体测定的操作步骤：（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（Bl-B2、Cl-C2、Dl-D2,El-E2,FI-F2、Gl-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀释度的待测血清O.05ml,不必更换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀释度的待
23、测血清0.05ml,A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀释度的待测血清O.05ml,A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8,E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1：16稀释度的待测血清O.05ml,A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀释度的待测血清0.05ml,All-A12孔（BIl-B12、CIl-Cl2、Dll-DI2、EIl-EI2、FlI-FI2、GII-GI2、HlI-HI
24、2）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100CCID3oO.05ml）；（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36CC0?孵箱中孵育2h；标本检测1: 10241:2“1: MI: 4 l J倒清对煦O1号标本A2号标本3号标本4号标*号麻本H6号标本号*8号标本s（4）另取一块96孔板纵向使用，做IOoCClD5o/O.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml,然后从0.1CClDSO/0.05ml加起，每孔0.05ml,每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加
25、至IooCClD50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔,每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4C冰箱中暂存；标本检测1:2Ct值35.O的样本为临界值。Ct值238.O的样本或无数值的标本为阴性。（2）OneStepReal-timePCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）双通道可以同时检测EV71和CVA16核酸，在提取核酸后短时间5小时）内检测到标本中是否含EV71或CVA16核酸。反应体系配置反应体系共25ul,模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5UI模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。a.先将试剂解冻，从试剂盒中取出
26、相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置25HI反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：b.将下述反应液混匀离心后，按照每管20UL分装于适用的PCR管中。试剂组成1份样品的量荧光RT-PCR反应液12.5ul逆转录酶0.51Taq酶0.51引物和探针3U1H203.51C加样：将提取好的样本RNA,分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25UL荧光RT-PCR循环条件设置程序循环数温度（摄氏度）反应时间114230min2195t2min34095七1
27、0S60(35s60C时收集荧光信号结果分析条件设定和结果判断阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本。阳性对照：提取好的阳性核酸作为模板RNA。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。Ct值W35.O的样本为阳性。Ct值无数值的标本和Ct值238.O的样本为阴性样本。38.0Ct值35.O的样本为临界值。注：荧光PCR同时读取FAM和HEX,进行双通道检测，FAM荧光Ct值为CVA16的结果，HEX荧光Ct值为EV71的结果。四、生物安全根据2006年1月11日卫生部制定的人间传染的病原微生物名录，柯萨奇病毒、埃可病毒、EV71型和目前分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。所有操作应遵守国家相关法律法规。
