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1、猪塞尼卡谷病毒的检测重组酶恒温扩增法地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源猪塞尼卡谷病毒的检测重组酶恒温扩增法为山东省市场监督管理局关于下达2020年山东省地方标准制订项目计划的通知的任务之一。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施，由山东省畜牧业标准化技术委员会归口，由山东师范大学组织起草。（二）起草单位和主要起草人信息起草单位信息表IF单位名称统一社会信用代码所在地联系人联系电话I山东师范大学1237000049557382XT济南市曾庆良0531-861800152山东师大瑞柏生物科技有限公司91370100MA953QUF9T济南市陈蓄158066200063招远市动物疫病预防控制
2、中心12370685493571054B招远市苏兴海133613080964济南市农业科学研究院123701006898455479济南市单波155531052575滨州市环境保护科学技术研究所12371600F50480670B滇州市刘姝0543-31571586临胸县政务服务中心12370724MB2881411W潍坊市晶(0536)33566287桂林市临桂区动物疫病预防控制中心12450322677712026B桂林市138773237668安普未来（常州）生物科技有限公司91320412MA24U74R38常州市宋江华15958215004起草人信息表顺序姓名身份证号所在地所在单位联
3、系电话1陈蕾370283198505055229济南市山东师范大学/山东师大瑞柏生物科技有限公司158066200062于观留150204198806050636济南市山东师范大学157064196813苏兴海370624197501032617招远市招远市动物疫病预防控制中心133613080964吕政印371202197509137414济南市济南市农业科学研究院130317678095李现胜370724197409264795潍坊市临胸县政务服务中心135626739516刘姝372301198501100021滨州市滨州市环境保护科学技术研究所180054380777廖炳次450322
4、197607010513桂林市桂林市临桂区动物疫病预防控制中心138783203868杨桂文370102196705252996济南市山东师范大学133566619229刘国宪130406198204090331常州市安普未来（常州）生物科技有限公司13810919601（三）起草过程1起草单位和主要起草人任务分工人员.L陈蕾负责与标准相关材料的收集整理，标准草案的起草，征求意见后标准修改等工作于观留负责标准的申报，征求意见的发起，专家审查会议的组织等工作苏兴海、吕政印检测引物和探针的设计及筛选廖炳次、刘国宪检测方法特异性和敏感性分析李现胜、刘姝组织样本和环境样本的收集2起草过程2021年1月
5、-2021年5月：成立标准起草组，召开项目协调会，明确标准各项指标，分解检验测试等各项任务，并制定具体工作进度计划。2021年6月-2021年7月：召开标准起草组会议，进行阶段性总结，针对存在问题研究解决对策，对标准部分内容进行调整，安排比对试验，确定试验任务。2021年8月-2021年9月：对具体实验、实验数据进行整理和汇总。2021年9月-2021年10月：对实验进行验证，并拟定塞尼卡谷病毒的恒温扩增检测技术规范草案。2021年10月-2021年12月：对形成的草案进行征求意见，共对30个单位或者专家发送了“地方标准草案征求意见稿”，收到地方标准草案征求意见稿后，回函的单位或专家数：30个
6、。收到地方标准草案征求意见稿后，回函并有建议或意见的单位或专家数：30个。委托山东省动物疫病预防与控制中心、山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东省农业科学院家禽研究所对标准草案中的标准技术指标进行验证，验证结果一致。2022年1月-2022年3月：根据意见对草案进行修改，整理相关材料，申请审查。2022年3月-2022年12月：根据审查意见对草案进行修改。2023年2月-2023年4月：山东省畜牧兽医局组织有关专家对该地方标准的标准送审稿和编制说明进行了会审。审查委员会听取了标准编制情况汇报，对标准文本进行了逐章、逐条审查，对标准编制说明等进行了审查。标准编制小组认真审阅，采纳了审查委员的意见
7、和建议，并根据审查意见进行修改形成报批稿。二、地方标准制定目的和意义2002年，塞尼卡谷病毒(SVV)首次在美国被报道，病毒被发现于PER.C6细胞培养物中，被认为是细胞培养基的污染物。2007年SVV被发现是引起加拿大发生的猪原发性水泡病(PlVD)的致病病原。2015年以后，在美国、巴西等多国均发现SVV感染导致猪发生PIVD的临床病例，进一步确定了SVV的致病性。猪感染SVV后通常表现为急性、自限性水疱症状。临床表现为采食量下降，之后鼻吻突处出现水疱性病变，可见1个或多个大小不一、充满液体的囊泡，囊泡破裂后发展成溃疡病变，在感染后1015d形成厚痂。水疱性及溃疡性病变也可出现于蹄冠部趾间
8、裂和冠状带周围，导致边缘上皮疏松坏死，严重者跛行，站立困难。有些母猪腹部和乳房部出现红色斑点，或伴有发热和厌食症状，甚至发烧(39540.5),部分跛行的母猪体温可达41.0o新生仔猪体态虚弱，嗜睡，不愿吸乳，并出现急性死亡，在蹄掌部可见部分化脓性小泡。塞尼卡谷作为一种新发传染病，不仅能引起猪只的死亡，带来经济损失，同时还会导致与口蹄疫(FMD)等水疱性疫病极为相似的临床症状，造成确诊困难。山东省已于2022年8月通过了全省域免疫无口蹄疫区和无高致病性禽流感区的国家评估，成为全国首个双病无疫省，水疱性疫病的精准诊断对于FMD的日常监测至关重要。因此开发快速、灵敏、方便的现场诊断方法，制定SVV
9、诊断的相关标准对于SVV的防控及FMD的准确诊断变得尤为重要，对猪场SVV的诊断和FMD的净化具有重要意义。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据(一)地方标准编制原则本标准内容的选取、格式等严格按照GB/T1.1标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的要求，充分调研最新技术水平及当前市场情况，认真分析所涉及领域的标准化需求，以“科学性、一致性、适用性和先进性为基本原则，以保证SVV的精准、快速检测为目标进行编写，力求结构严谨，文字简洁易懂，逻辑清晰，引用文件规范、准确，易于理解和应用。现确定编制原则如下。1.科学性本标准编制内容是以大量的国内外SVV检测方法为基础，通过大量的实验数据
10、对比分析进行编写。制定本标准时充分考虑了标准的可操作性，制定过程中搜集相关资料，进行严格的比对分析，保证本规范科学可行，简单易行，便于操作。并且委托山东省动物疫病预防与控制中心、山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东省农业科学院家禽研究所对标准草案中的标准技术指标进行验证，验证结果一致。2.一致性原则按照“制修订的标准应与国家现行的法律法规保持相对的高度协调性的原则，在本标准制定过程中，与国家现行的法律法规保持了高度的一致。3.适用性原则按照“制修订的标准应适用于行业的发展和生产实际，为标准具有广泛的参考性和实用性奠定基础”的基本原则，在本标准制定过程中，充分调查并广泛征求了不同类型企事业单位如
11、大专院校、科研机构及生产企业的专家的意见，在综合分析、集体讨论的基础上，进行修改、充实和完善，因此，本标准具有很强的适用性。4.先进性原则在本标准制订过程中，按照先进、适用和可操作的原则，在检索国内外相关标准、文献的基础上，以前期研究数据为基础，然后结合后期试验验证，达到科学性与实用性的有机统一，以确保本标准的适度先进性。本标准编制内容通过自行设计特异性的引物探针，提取病毒DNA后利用RPA荧光法检测SVV,该快速诊断方法与现有技术相比具有很强的特异性、敏感性、重复性，且与荧光定量PCR法的敏感性一致，比普通PCR法高IOoO倍，且大大缩短了检测时间，具有快速和可操作性强的特点。（二）主要技术
12、内容和确定依据本标准根据GenBank中已经发表的SVV的全基因组序列设计RPA法所需的特异性引物及荧光探针，经过筛选后确定最优的特异性引物及探针，建立了针对SVV的RPA检测方法。研究结果表明该方法具有良好的特异性，与FMDV、PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV均无交叉反应；敏感性试验检测下限为单拷贝/L,与荧光定量PCR灵敏度一致，优于普通PCR的灵敏度1000倍；对批内重复性试验和批间重复性试验检测结果进行统计学分析，结果表明批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于5%o对临床样本检测,RPA法也具有较好的敏感性。本标准所建立的检测方法敏感性高、特异性强、具有稳定的可重复性，
13、可用于对SVV临床感染率的调查、定量检测及后期研究。1.引物及探针的选择引物探针序列如表1所示：表LRPA引物序列引物序列SVV-RPAFTtctaaagcgcaaattcgtccaaaacaacgacSVV-RPARCCAGAATGTTGAGCCAACATAGAAACAGArTGCSVV-RPAPTAAAGAATTTGGAAGCCATGCTCTCCTACTTC-FAM-dT-A-THF-C-BHQ1-dT-AGGAACACTACTCG重组酶恒温扩增（RecombinasePolymeraseAmplification,RPA）的引物长度比常规PCR要长一点，在RPA反应中单链结合蛋白与双链D
14、NA的结合需要长度为3O35bp以上的核昔酸才能完成。引物的GC含量在应占30%70%,在5,端的35个核昔酸尽可能减少G的出现;在3,端的3-5个核昔酸应有G、C出现，以连续多个出现为宜。探针的序列应不与特异性引物识别位点重合，长度为46-52nt,探针共有四个修饰位点：距离5,端235nt的中部位置标记一个THF,作为核酸外切酶的识别位点，THF上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团间距为2-4nt,THF距离3,末端215nt针对目的基因片段，本试验设计了三对引物及探针，分别进行RPA荧光法反应，筛选最优的引物探针。（图1、2）图L特异性引物的筛选图2.荧光探针的筛选用上述
15、筛选出的最优引物对阳性质粒进行PCR扩增，得到一条148bp左右的DNA片段（图3）。送生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测定结果与目的片段序列完全一致。500bp200bp WObpM：DNAMarkerDL2000；1：重组质粒；2：连接前PCR产物图3.RPA扩增目的条带2.最佳反应体系和反应条件的确定多次试验比对确定最佳反应体系为：50L体系，其中DEPC水25.4L、恒温扩增试剂15L（Abuffer12.5L.Bbuffer2.5L）.上下游引物（终浓度10M）各2L探针（终浓度10M）0.6j模板5L。RPA荧光法反应条件为：39。CImin,3930s,40个循环。3.
16、敏感性试验按上述优化的反应条件，选择LOxlO6,L010LOxlO4.l.OxlO3、LOXIO2、l.OxlO】、1.0x10拷贝L的7个浓度梯度的质粒作为模板，进行荧光定量PCR,RPA和PCR实验。Cycle图4.荧光定量PCR扩增曲线（单位：拷贝uL）试验结果显示，荧光定量PCR和RPA荧光法能检测出的最低模板浓度为单拷贝/L（图4-5）,而常规PCR能检出最低模板浓度为1.0x103拷贝L（图6）,RPA荧光法的敏感性与荧光定量PCR一致，比常规PCR高IoOO倍。除此之外RPA荧光法检测用时仅需20min,且不需要复杂的变温步骤,在常温条件下即可进行反应，对检测设备要求低，可以实
17、现养殖、运输、屠宰等生产过程中的即时检测。I(FePOISUl 10CPoleUlIO4CPoeeUl IOlqMMeuIIOpocul I(PePOieUl IOOCPoc ul图5.敏感性试验（单位：拷贝L）MarkerM：DNAMarkerDL2000图6.普通PCR敏感性试验（单位：拷贝/L）4特异性试验以FMDV（口蹄疫病毒）、PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）、CSFV（猪瘟病毒）、PEDV（猪流行性腹泻病毒）、TGEV（猪传染性胃肠炎病毒）的DNA为模板进行RPA检测，检测结果均为阴性，说明本检测方法特异性良好。1.5001.200g励SWg0.6000.300FMDV、PRR
18、SVsCSFV、PEDV、TGEV0.0000.003.006.009.0012.M1S.0018.0021.0024.0C27.0030.0Cyde图7.特异性试验5重复性试验为验证RPA荧光法检测结果的可重复性，选取1O1O2.1O1倍稀释的SVV质粒样本，以5OL体系连续进行3次扩增反应，不同浓度梯度下的3次重复实验的扩增曲线几乎完全重合（图8）。对批内重复性试验和批间重复性试验检测结果进行统计学分析，结果表明批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于5%,说明该方法具有良好的重复性与稳定性（表2、表3）。pesulcopies/ulpiesul图8.重复性试验表2RPA荧光法的批内
19、重复性试验结果样品3次重复性试验的Ct值变异系数%123平均值标准差1,0x10*2.682.722.862.750.0772.8LOXlOS9.689.789.399.62O.I651.711.0IO416.8416.9316+4116.73+0.2271.36表3RPA荧光法的批间内重复性试验结果样品3次重复性试验的Ct值_变异系数%123平均值标准差I10.9410.5810.2710.60.2742.58210.4110.6910.5310.540.1151.09310.7510.4310.8810.690.1891.766.临床样品检测对临床送检的20例具有塞尼卡谷疑似症状的猪进行常
20、规PCR、荧光定量PCR和RPA荧光法检测。试验结果显示，荧光定量PCR和RPA荧光法的敏感性一致,均优于常规PCR法(p0.01)。表4三种检测方法比较结果常规PCR荧光定量PCRRPA-荧光法SvV阳性病例IO1616阳性率(%)5080807.市面上常见厂家恒温扩增试剂盒对比试验Cycle图9.三种恒温扩增试剂盒对比试验选取了目前市面上常见的三家恒温扩增试剂的生产厂家进行了对比试验，试验结果表明三个厂家的恒温扩增试剂盒的扩增效果相近，检测结果一致，表明本检测方法稳定性良好，不受试剂生产厂家的影响。四、与现行相关法律、行政法规和其他标准的关系制定标准时严格按照国家有关生物制品与诊断试剂质量
21、方面的法律法规要求，严格执行计量法、标准化法，其内容完全符合国家有关规定。本标准中不存在与现行法律、行政法规、强制性标准冲突或不协调的内容。五、重大分歧意见的处理过程、处理意见及其依据对标准制定过程中的重大分歧意见，我们广泛征求了农业高校、科研院所等30个单位或者专家的建议，依据测定结果和专家意见，综合形成对该标准重大分歧意见的处理。根据专家意见，将该地方标准的名称由塞尼卡谷病毒的恒温扩增检测技术规范更改为猪塞尼卡谷病毒的检测重组酶恒温扩增法，并按照GB/T1.1-2020要求，修改规范性引用的引导语、规范附录格式以及对计量单位进行规范书写等。六、对地方标准自发布日期至实施日期之间的过渡期（以下简称过渡期）的建议没有对过渡期的建议。七、其他需要说明的内容本标准起草时参考了中华人民共和国国家标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法，DB37T4032-2020非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范，DB37T4052-2020小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范等，本标准与以上标准的一致性程度为非等效。根据审查会专家意见，将该地方标准的名称由塞尼卡谷病毒的恒温扩增检测技术规范更改为猪塞尼卡谷病毒的检测重组酶恒温扩增法。
