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1、蛋白质分子溶液结构与功能的NMR研究部分,蛋白质的NMR研究内容,蛋白质溶液三级结构的测定蛋白质的构象变化蛋白质与靶分子（靶蛋白、核酸、配体小分子、药物）的相互作用蛋白质的动态特性蛋白质的折叠机制和折叠路径,一.确定生物分子的溶液三维结构,蛋白质分子：天然态蛋白质、突变体蛋白质、部分折叠态蛋白质、非天然态蛋白质。核酸分子：DNA、RNA蛋白质复合物：蛋白质与蛋白质复合物、蛋白质与DNA或RNA复合物，蛋白质与药物小分子复合物、蛋白质与拮抗剂小分子复合物。,蛋白质溶液三维结构确定的技术基础,高场核磁共振波谱仪的发展 500MHz600 MHz750 MHz800 MHz900 MHz多维（二维、
2、三维、四维）核磁共振实验技术的发展 梯度场多维NMR脉冲程序TROSY类型多维NMR脉冲程序取向介质中蛋白质残余偶极相互作用检测方法处理和解析多维核磁共振数据的软件开发研究,蛋白质溶液三维结构确定的重要性,蛋白质结构与功能关系研究的重要部分蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础可在结构基础上研究蛋白质发挥生理功能的活性部位可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系蛋白质动态特性与结构特性密切相关,二.天然态蛋白质结构功能研究,蛋白质与药物小分子、拮抗剂等结合的活性部位确定蛋白质发挥生理功能时活性部位的构象变化蛋白质动态特性与功能的关系蛋白质折叠/去折叠蛋白质稳定性蛋白质在水溶液中多构象的平衡
3、蛋白质肽键的顺反异构与功能关系蛋白质中的水分子,Research:3D solution structure NOE,3JN,3J,Hydrogen-bondbinding site NOE,3JN,3J,Hydrogen-bondconformational change NOE,3JN,3J,Hydrogen-bondfolding/unfolding NOE,H,3JNbackbone dynamics 15N-T1,15N-T2,15N-NOE,H/D exchange protein-protein interaction NOE,H protein-nucleic acid int
4、eraction NOE,H,三.蛋白质复合物相互作用的研究,蛋白质与蛋白质相互作用研究蛋白质与核酸相互作用研究蛋白质与拮抗剂和底物小分子相互作用靶蛋白质与药物小分子相互作用,Research:conformation of the complex conformation of protein conformation of substrate,peptide,-binding site on protein binding interfaceMethodology:isotope labeling of protein isotope labeling of nucleic acid is
5、otope labeling of peptide hetero-nuclear filtering NMR experiments docking by using software package,四.非天然态蛋白质的研究蛋白质片段的溶液构象变性剂作用下蛋白质的动态特性变化脲变性、酸变性蛋白质的特性与残存结构五.膜蛋白质分子的研究膜蛋白质与膜脂分子相互作用,Study of non-native protein,Research:refolding process of protein dynamic properties of non-native protein residual st
6、ructures of proteinProblems:extensive overlap of peaks reducing the NOEs averaged over an ensemble of conformations broad line widthsMethodology:isotope labeling of protein site-directed mutagenesis hydrogen-exchange pulse labeling,多维NMR研究蛋白质溶液三维空间结构及功能关系,NMR 方法是确定蛋白质溶液三维结构的唯一有效手段,确定蛋白质溶液三维结构的重要性：蛋白
7、质结构与功能关系研究的重要部分 蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础 是研究蛋白质发挥生理功能的活性部位的必要条件 可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系 蛋白质动态特性与结构特性密切相关,(1)多维NMR确定蛋白质分子溶液三维结构的基础,蛋白质的结构信息20种氨基酸：氨基酸由H、C、N、O、S等元素组成，提供链长和键角信息。蛋白质的一级结构：多肽链中氨基酸残基序列。提供蛋白质的氨基酸组分，排列顺序以及各类原子数。蛋白质的二级结构：蛋白质分子不同肽段主链原子在三维空间中不同的排列规律性，表现为-螺旋，-片层、转角和环等基本结构单元。在不同二级结构单元的肽段中，肽键的二面角不同，主链氢原
8、子间的相对位置或距离不同。蛋白质的三级结构：蛋白质的二级结构单元在三维空间中的相对排列，提供原子间的远程距离信息。,核磁共振波谱信息化学位移：氨基酸的H、C原子的核磁共振峰在-螺旋与链中的化学位移分布呈现规律性的差异。J-偶合：反映了肽键的二面角(，)大小。-螺旋和片层二级结构单元中的J-偶合数值范围不同。NOE：核自旋之间的偶极偶极相互作用产生的交叉驰豫导致NOE现象，在两个核之间的距离小于5时可以观察到NOE信号。,波谱信息与结构信息的对应化学位移可以直接用作判别形成螺旋、片层的氨基酸残基肽段的实验依据。J耦合可用以直接确定肽键的二面角，。NOE信号强度与两个核之间的距离六次方成反比。由N
9、OE强度可以确定两个原子之间的距离，在螺旋与片层中氢原子之间的NOE强度呈现不同的特征。可用以精确地测定螺旋与片层。由主链原子间远程相互作用提供的NOE可以精确地测定蛋白质分子的三级折叠。,多维NMR确定蛋白质分子溶液三维结构的流程图,NMR研究蛋白质中存在的问题,同核(1H-1H)NMR在确定蛋白质溶液的结构方面，可以获得小于100个残基的小蛋白的溶液结构，在准确度方面类似于2.0-2.5 分辨率的晶体结构 随着蛋白质分子量的进一步提高，由于化学位移的重叠或简并，使得在(1H-1H)NMR方法中所使用的自旋系统识别和序列识别方法不再完全有效其次是随着分子量增加，谱线变宽，因而使得较难利用建立
10、在小的同核耦合(耦合常数12Hz)之上的一些位移相关实验,金黄色葡萄球菌核酸酶920 1H resonances in 10 ppm722 13C resonances in 185 ppm143 15N resonances in 220 ppm,小蛋白和大蛋白二维同核NMR谱的比较,BmP02(28个残基)ADR6(115个残基)部分NOESY谱,增加NMR波谱的维数,从二维扩展到四维可提高谱图分辨率,二维三维四维,1H/13C/15N多维核磁共振波谱示意图,单键异核耦合用于磁化强度传递,磁化矢量之间的传递是建立不同自旋之间联系的方式，也是多维核磁共振方法的基础。溶液核磁共振方法中常见的传
11、递方式，一是通过跨键连接，也就是标量耦合进行传递，如同核传递，异核传递；二是通过跨空间相互作用。对于1H 的同核传递通过3JHH，一般取1/(2*3JHH)，约3080ms。对于脂肪链13C 同核传递通过1JCC 传递，一般取3/(4*1JCC)，约1020ms。对于1H-13C 的异核传递通过1JCH，一般取0.8/1JCH，约6.7ms。,蛋白质分子稳定同位素(13C,15N)标记,(2)蛋白质样品的准备,需要对白质分子进行稳定同位素(13C,15N)标记for protein of M.W.up to 20 kDa50%2H labeling 95%ul 15N labeling 98%
12、ul 13C labeling95%ul 15N,98%ul 13C labeling for protein of M.W.40 kDa or higher50%2H,95%ul 15N,98%ul 13C labeling,(3)基本的多维NMR实验,Multi-dimensional NMR pulse program:for backbone resonance assignments for side-chain resonance assignments for NOE measurements for J-coupling constant measurements for H/
13、D exchange experiments for 15N relaxation experiments,三维异核实验脉冲程序：用于氨基酸残基序列(主链)指认的脉冲程序3D1H-15N-13C HNCA,HNCO,HN(CA)CO,HN(CO)CA,HN(CA)HA,HCACO,HCA(CO)N用于氨基酸残基的侧链指认的脉冲程序3D1H-15N-13C CBCA(CO)NH,HNCACB,HBHA(CBCACO)NH,CC(CO)NH3D1H-13C HCCH-COSY,HCCH-TOCSY,CBCA(CO)NH脉冲程序:顶部是磁化矢量传递路径，紧挨其下的I3,I2等对应于不同的磁性核。=1
14、0；=y；1=y；2=x,-x频率分辨（TPPI或者States-TPPI）；3=x；4=x；5=2(x),2(-x)；rec=x,2(-x),x。,(4)三维NMR波谱分析,共振峰指认 共振谱峰分布范围 1H：10ppm；13C：185ppm；15N：220ppm两种指认策略：,三维异核波谱谱峰指认(基于J耦合的共振峰指认):首先完成氨基酸序列(主链)指认然后进行氨基酸残基的侧链(自旋系统)指认,SNase的HNCA 谱,SNase 的HNCA和HNCO波谱,Ssh10b CBCA(CO)NH/HNCACB谱 K64-K68条带图。从左到右，每个残基的CBCA(CO)NH和HNCACB谱图依
15、次相邻。HNCACB谱上浅色的峰是负峰。,Ssh10b HNCO/HN(CA)CO谱 K64-K68条带图。从左到右，每个残基的HNCO谱和HN(CA)CO谱依次相邻。,Ssh10b的HBHA(CO)NH和HBHANH实验，S79G82条带图。从左到右，每个残基的HBHA(CO)NH和HBHANH谱图依次相邻。标的是1H，标的是1H。在谱上，1H和1H符号相反。,Ssh10b残基I76的CC(CO)NH和HCCH-TOCSY谱。（A）CC(CO)NH实验的15N平面；（B）HCCH-TOCSY实验I76的侧链13C各个对应的1H-1H 平面。,NOE共振峰指认1H-15N NOESY-HSQC
16、,蛋白质中常见二级结构单元典型的NOE相关性,Characteristics of secondary structural elements,(1)-helix strong dNN(i,i+1)NOEs(continuous stretch)strong dN(i,i)and dN(i+1,i)NOEs medium dN(i,i+3)NOEs dNN(i,i+2)NOEs d(i,i+3)NOEs weak or absent dN(i,i+1)NOEs,(2)Anti-parallel pleated sheet strong NOEs:dN(i,i+1)medium NOEs:dNN
17、(i-1,j+1)dNN(i+1,j-1)dN(i,j+1)dN(j,i+1)d(i,j)weak or absent NOEs:dNN(i,i+1),Anti-parallel pleated sheet图例,(3)Parallel pleated sheet strong NOEs:dN(i,i+1)medium NOEs:dN(i,j)or dN(j,i)weak or absent NOEs:dNN(i,i+1)No d(i,j);dNN(i-1,j+1);dNN(i+1,j-1)NOEs,(4)TurnsReverse turn II:strong NOEs:dN(2,3)&dNN(
18、3,4)weak NOEs:dN(1,2)&dN(3,4)some dN(i,i+2)&dNN(i,i+2)NOEs require a Gly at position 3 small 3JN coupling constant,Reverse turn I:strong dNN(2,3)&dNN(3,4)NOEsweak dNN(1,2),dN(2,3)&dN(3,4)NOEssome dN(i,i+2)&dNN(i,i+2)NOEsHalf turn:strong dN(2,3)&dN(3,4)NOEsweak dN(1,2)&dNN(3,4)NOEs some dN(i,i+2)NOEs
19、no dNN(i,i+2)NOEs,-helix,Anti-parallel pleated sheet,Anti-parallel pleated sheet&Reverse turn,确定J-耦合常数,加WATERGATE水峰压制的HNHA实验脉冲序列。其中 1=5.3ms，2=T/2=13.4ms。1H通道标2的脉冲（2ms SEDUCE-1）用于水峰倒返，并且结合在延时1之内。应该尽可能短，以减小弛豫引起的信号损失。相循环为：1x,x,-x,-xt2间接维频率区分（TPPI或者States-TPPI），2x，3xt1间接维频率区分（TPPI或States-TPPI），4x,y，recx
20、,-x,-x,x,y,-y,-y,y。,HNHA实验的15N平面。1H的峰在谱图上是负峰。,获得弛豫参数现有谱仪的磁场强度下主要是偶极弛豫起作用 这里J称为谱密度函数，同分子运动方式及快慢有关,SNase三个片段的R1,R2和1H-15N NOE,R2来源于ns时间尺度的分子转动和ms-s时间尺度的构象交换,确定化学交换,Ssh10b 异核相关纵向弛豫/化学交换实验,残余偶极耦合常数确定,(5)确定蛋白质结构,二级结构确定 化学位移指数(Chemical shift index,CSI)方法 基于NOE,二面角,氢键信息,确定三级结构 基于NOE,二面角,氢键等距离约束进行结 构计算 理论上
21、n(n-1)/2 对 1H 间的距离确定了蛋白质三维结构(n为蛋白质含有的 1H 数)以金黄色葡萄球菌酶（149个氨基酸）为例，1H 对数目为422,740。以金黄色葡萄球菌酶（149个酸）为例，1H 对数目为422，740。,1.NOE约束,以特定的已知参考距离rref及其NOE强度Vref为参照，按下式进行NOE强度到距离的转换 常用参考距离如下：-CH2-的两同碳1H之间的距离：1.78 芳环上相邻1H（1H，1H）距离：2.48-Helix结构单元的1HNi-1HNi+1：2.80-sheet上的1Hi-1HNi+1：2.20 NOE通常以半定量方式:强,中,弱(强：2.7；中：3.3
22、；弱：5.0)分类作为距离约束上限,2.二面角约束,各类3J-偶合常数对应的Karplus公式参数3J()=A cos2+B cos+C,3J-偶合常数与二面角通过Karplus关系式联系 3J-偶合还可直接作为约束引入结构计算,在结构计算程序的目标方程中加入下项：KJ是权重因子，3Jexp 值是实验测得的偶合常数，3Jcalc值是根据扭转角按Karplus关系式计算出的理论偶合常数。,3.取向约束,残余偶极偶合（RDC）正比于磁场强度的平方，表现为直接键连原子间的单键标量偶合引起的裂分有小的场依赖性改变。可通过准确测量在不同磁场强度下的1J偶合常数获得RDC信息。残余偶极偶合约束给出的是分子
23、内一对耦合的磁性核（比如15N-1H，13C-1H，15N-13C）之间的矢量相对于整个分子某个固定轴的相对取向，它给出真正的长程约束信息。,4.氢键约束,H-键可通过1H交换实验和/或跨H-键偶合实验来确定H-键以类似于NOE的距离约束方式引入结构计算，1H 受体的距离的典型值为：1.8-2.0，受体 1H直接共价结合的原子的距离为2.7-3.0，后者起到限制H-键键角作用。,5.结构计算,在笛卡儿空间，每个原子都独立运动，共价结构必须用力场势能来巩固；在扭转角空间，共价结构被固定在理想值，并无影响共价结构参数的自由度。依赖于所用结构计算算法，特殊共价键如二硫键，环肽键必须用距离约束来维持。
24、实践上，首先从经验数据及氨基酸序列计算出随机的折叠起始结构，然后计算机尝试折叠该结构使之满足实验数据的要求，通过引入势能概念，建立目标方程来衡量构象与约束集的吻合程度，将结构计算转化为使目标方程最小化。目前应用最广泛的是基于模拟退火算法。,笛卡儿空间的分子动力学模拟退火,这种算法通过数字求解牛顿运动方程来获得分子体系的轨迹,以各原子的笛卡儿坐标为自由度。计算程序是Xplor及它的后续版CNS(Brunger et al.,1998)。由n个位置ri，质量mi的粒子构成的体系的经典动力学服从牛顿运动方程：力Fi由势能方程Epot及笛卡儿坐标按下式给出：,模拟退火使用简化的势能方程，包括维持共价结
25、构的经验势能项如键长，键角，二面角，手性，平面性，替代 LennardJones和静电非键相互作用的简化排斥势，以及实验约束势能项，例如Xplor使用以下力场：,扭转角空间分子动力学,Dyana所用的快速扭转角动力学的核心思想是链式分子如蛋白，核酸，可以很自然地表示成由n+1个彼此之间有n个可旋转共价键连接的刚体组成的树状结构，每个刚体由一个或多个原子构成。树结构的基点常为多肽链的N端，“叶子”终点是侧链末端和肽链C端。自由度是n个扭转角，构象由所有的扭转角确定。目前流行的计算程序是DYANA。,笛卡儿空间与扭转角空间分子动力学比较,结构分析,一般包含两方面的内容：（1）考察计算出的分子坐标与
26、实验数据之间的吻合程度；计算程序如CNS、DYANA都会在计算出结构的同时给出能量及约束违规报告，通过对约束违规进行统计分析，同一违规在系综的大部分结构甚至全部结构中都出现的话，应仔细检查该违规对应的指认和峰积分是否有错误。（2）考察计算结果的各种结构几何特性与对应的经验允许值之间的吻合程度；经验允许值可由理论计算或从蛋白质数据库(PDB)、核酸数据库（NDB）、剑桥结构数据库（CSD）统计衍生得来。常用的分析软件有MOLMOL、AQUA、PROCHECKNMR、WHATIF、PROSA等。,金黄色葡萄球菌酶30个结构的叠加,金黄色葡萄球菌酶140片段结构的叠加,影响蛋白质溶液三维结构正确测
27、定的因素,NMR 波谱中 NOE 交叉峰指认的正确性 被指认的 NOE 交叉峰的数量 长程NOE交叉峰正确指认的数量 NOE 交叉峰强度测定的正确性,蛋白质三维结构与功能,1.几个蛋白质的NMR三维结构,金黄色葡萄球菌酶(SNase),蛇毒蛋白CobrotoxinII,蛇毒蛋白CobrotoxinII结构叠加图,人白血病细胞调亡相关蛋白质(PDCD5),人源PDCD5基因编码蛋白质在肿瘤细胞中表达，并且在细胞凋亡过程中快速地由细胞质传递到细胞核中,人翻译控制的肿瘤蛋白(TCTP),TCTP蛋白与肿瘤相关，在癌细胞中通常含量增加，而在肿瘤回复中被强烈下调，是一个新的抗凋亡蛋白有180个a.a,人
28、胎儿肝脏新基因(c6orf115)编码的蛋白质,从人胎儿肝脏中克隆出来新基因编码的蛋白质，它有81个氨基酸，动植物里均保守存在，功能未知。结构显示它是个winged helix fold。这种折叠一般存在于转录因子中，具有DNA结合的活性。,嗜热古菌核酸结合蛋白Ssh10b的NOE分布图示,Ssh10b溶液三维结构,2.金黄色葡萄球菌酶体外折叠的研究,主要的研究片段：SNase20(1-20)SNase28(1-28)SNase36(1-36)SNase79(1-79)SNase102(1-102)SNase110(1-110)SNase121(1-121)SNase135(1-135)SNa
29、se137(1-137)SNase139(1-139)SNase140(1-140)SNase141(1-141)G88W110G88W121V66W110V66W121,对SNase110(1-110残基)片段及其G88W和V66W 突变体(G88W110、V66W110)的折叠研究 G88W110 V66W110 SNase110,SNase110(1-110残基)，SNase121(1-121基)，SNase135(1-135残基)片段的折叠路径研究 Two Folding pathways：Thick arrow:Folding pathway energetically more f
30、avorable for SNase fragmentsThin arrow:Folding pathway disadvantage energetically for SNase fragments,SNase的-与-亚结构域片段(SNase121与SNase 3)复合体的溶液三维结构和相互作用机制的研究 SNase121在复合体中的HSQC谱 SNase121的HSQC谱可以看到SNase121在复合体中的谱峰分布与SNase的HSQC谱近。,SNase3的构象:在复合体中的HSQC谱 在水溶液中的 HSQC谱可以看到SNase 3在复合物中已具有一定的构象。,SNase*DNA复合物的
31、NMR研究在复合物中SNase*的HSQC谱 SNase的HSQC谱,3.凋亡相关蛋白PDCD5的研究,通过化学位移和弛豫参数对难以解析结构的蛋白质(凋亡相关蛋白PDCD5)进行结构特征鉴定,N端,核心结构,C端,4.Ssh10b与核酸相互作用温度依赖性的结构基础,Ssh10b在核磁谱图上呈现两种象，比例与温度相关谱图分析表明两种构象是L61-P62顺反异构造成的,L61-P62反式,顺式,在新药发现中的NMR 应用,An important technique in support of structure-based drug design provide information on t
32、he nature of molecular interactions,identify weak-binding compounds to aid development of the drug-like inhibitors for use as lead compounds in drug discovery.,NMR进行新药研究的策略,检测蛋白质：1.选择性地同位素标记某种类型的氨基酸残基;2.segmental labelling:discrete segments of the polypeptide chain are uniformly labelled;3.Chemical-
33、shift mapping or Differential chemical-shift mapping检测底物小分子：Based on T2 and T1enhancement:the large differences in the rates of rotational and translational motions of a small molecule in the free state relative to when it is bound to a macromolecule 新的脉冲方法：SEA-TROSY:selects solvent-exposed amide pr
34、otons in uniformly deuterated 15N-labelled proteins dissolved in H2O by magnetization transfer from H2O.,二氢叶酸还原酶(DHPR),Met-13CH3 resonance regiona.Chemical-shift mapping 方法：绿色表示没有底物存在，蓝色表示存在底物类似物pyridine-2,6-dicarboxylate(PDC)b.Differential chemical-shift mapping方法：蓝色表示结合PDC，红色表示结合4-chloro-PDC.,SEA-
35、TROSY脉冲方法,Conventional 15N,1H-HSQC,15N,1H-TROSY,SEA-TROSY selects solvent-exposed 1HN,Methods based on T2 and T1enhancement,1.T2(小分子)T2(蛋白质)the resonance lines in the NMR spectra of small molecules are much narrower than those in the spectra of macromolecules.2.T1(小分子)transferred NOEs:small positive
36、 NOEs for free small ligand;negative NOEs for bound ligand.,SAR(structureactivity relationship)by NMR,SAR by NMR:use of protein chemical-shift changes to screen for low affinity ligands,and the collection of structural information to direct a linked-fragment approach to enhancing binding affinities.
37、,a,b.Small molecules that bind to two distinct sites on the target protein.A second screen of close analogues to the hit(s)can be used to optimize the affinity for the sites.c.Knowledge of the positions of the two sites in the protein is then used to guide the synthesis of compounds in which the two small-molecule fragments are linked(it is possible to obtain inhibitors that bind very strongly).d-f.Example of the design and discovery of a potent stromelysin.,
