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1、泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响,主要内容,1 材料与方法2 结 果与分析,动物的性别决定和性分化一直是生物学领域颇受关注的课题之一。目前已经知道,脊椎动物的性别决定机制主要有遗传性决定(Genetic sex determination,GSD)和环境性决定(Environmental sex determination,ESD)两大类。,有关温度对两栖类性腺分化影响的研究,早在20世纪初就有过报道。用高温322培育美洲林蛙(Rana sylvatica)的蝌蚪,发现有雄性化的趋势。以后在北非肋突螈(Pleurodeles poireti)、冠欧螈和滞育小鲵(Hynobius retar
2、datus)等一些(Triturus cristatus)两栖类,都有相类似的报道。在我国,有关两栖类的性腺分化以及温度对性腺分化影响的研究极少,仅中国林蛙(Rana temporariachensinensis)有这方面的报道(李新红等,2001)。,泽蛙(Rana limnocharis)体型小、分布广,是我国南方常见的种类。其生殖期较长,每年的4-9月都可以从野外获得性腺发育成熟的雌、雄蛙进行人工催产,获得受精卵,因此是进行发育生物学实验的好材料。本文采用不同温度培育泽蛙的性别尚未分化的蝌蚪,观察在不同温度条件下,蝌蚪的发育状况、性分化规律以及雌、雄性比变化,探讨温度对泽蛙性腺分化的影响
3、。,1 材料与方法,1.1 实验材料的获得 泽蛙捕获自福州市郊城门镇农田。2006-2007两年在泽蛙的繁殖季节(4-9月),挑选性腺发育成熟的雌蛙共150只,每批次人工催产雌蛙20-30只,获产率90.5%。,1.2 不同水温的培育方法,将同一批次刚孵出蝌蚪(Gosner 25期)随机分成5组,每组150尾,其中4组为实验组,分别设定为181、301、32 1、34 1温度处理组;在自然水温23-25中发育的则为对照组。,1.3 取材及组织学制片,按上述方法另外培育一批每批次的蝌蚪,用以定期取样,制作组织学切片,观察原始生殖细胞的迁移、生殖嵴的形成以及性腺分化。采用Bouin液固定组织,常规
4、梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;制作连续横切片,切片厚7um,HE染色。切片标本置显微镜(配冷光源数码相机)下观察、拍照。对完成变态的幼蛙,进行解剖区分精巢或卵巢结构。,1.4 数据分析,对于测量数据以平均值标准差(Mean SD)表示。以Spss 13.0统计学软件对实验数据进行V2测验(V2-Test),主要比较各实验组幼蛙的成活率和雄性率与对照组的差异显著性(P0.05为差异显著)。,2 结 果与分析,2.1 性腺发生及分化泽蛙的性腺分化以对照组2325 的为准。从孵化期蝌蚪开始至完成变态的幼蛙为止,体内原生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)的迁移、生殖嵴
5、和原始性腺形成,以及性腺分化过程如下述,2.1.1 原生殖细胞的迁移和原始性腺的形成,刚孵出的蝌蚪,观察蝌蚪躯干部过前肾和消化道的连续横切片,背大动脉之下腹膜上皮与消化道之间的背肠系膜上,可发现PGCs单个分布(图I:1),数量很少。PGCs呈圆形或椭圆形,胞体明显较其周围的体细胞大,胞径均值(长径x短径,下同)为10.8umx8.8um,核径均值为6.8umx5.2um。核大,着色浅,核膜清晰可见,核仁1-2个。,孵化后1 d蝌蚪,全长6.5 mm0.3 mm。切片观察,PGCs已迁移到背肠系膜两侧的腹膜上皮上,仍旧单个分布,胞径均值为11.4umx8.2um,核径均值5.9umx4.6um
6、。,4d蝌蚪,全长7.7mm0.6mm。在中肾管下方,靠近背大动脉的腹膜上皮上,左右两侧各向腹腔突出形成1对纵行隆起,此为生殖嵴(Germinal ridge)。刚出现的生殖嵴很小,由体细胞和PGCs构成。在生殖嵴中可以观察到1-2个PGCs(图I:5)。PGCs的胞径均值16.1umx12.2um,核径均值13.5umx10.5um。,6 d蝌蚪,全长912 mm0.5mm。生殖嵴体积略有增大,生殖嵴中的PGCs的数量增加,在一个切面上最多可见到5个PGCs(图I:6)。PGCs体积有所变小,胞径均值为14.6umx11.0um,核径均值10.6umx6.4um。从6 d蝌蚪至12 d蝌蚪,
7、生殖嵴变化不大。,17 d蝌蚪,全长17.2 mm0.8mm。生殖嵴中的PGCs和体细胞数量继续增多,体积增大。在生殖嵴中央出现了一个小腔隙,为初生性腔(Primary cavity)。PGCs和体细胞位于腔隙的周围。此时的生殖嵴可改称为原始性腺(Primordial gonad)。原始性腺横切面呈梨形。背方狭窄,通过背系膜悬挂于中肾管下的腹膜上皮两侧(图I:7)。观察期所有的蝌蚪切片标本,在原始性腺中都有大小不等的初生性腔。此时,还不能在形态上区分哪些原始性腺将分化成卵巢,哪些原始性腺将分化成精巢。,2.1.2 卵巢的分化,22 d蝌蚪,全长20.3 mm0.7mm。原始性腺体积明显增大,呈
8、长囊状。原始性腺中的初生性腔扩大,并且在腔的表面有一层单层扁平上皮,形成次生性腔(Secondary cavity)。PGCs位于腔的周围,并突向表面,在PGCs的周围分布着体细胞。PGCs形态变化不大,有的正处于有丝分裂期(图I:8)。,34 d蝌蚪,全长30mm1.5mm。大多数蝌蚪的后肢五趾形成。在原始性腺中,次生性腔周围的PGCs大部分已分化成卵原细胞(图II:9)。卵原细胞呈圆形或椭圆形,体积较大,细胞核大,核内的染色丝明显。胞径均值为39.4umx34.2um,核径均值33.9umx27.2um。此时的原始性腺可以改称为卵巢,其中的次生性腔称为卵巢腔。,2.1.3 精巢分化,30
9、d蝌蚪的原始性腺切片中观察到一种体积较小的原始性腺,呈椭圆形。初生性腔扩大,腔的表面没有单层扁平上皮,腔中出现了一些体细胞和血细胞。PGCs分布在腔的周围,胞径均值为14.1umx10.3um,核径均值为9.9umx7.6um(图II:11)。,在34-36d 的蝌蚪中,该类型原始性腺的初生性腔中,体细胞数增多,腔隙变小。腔外的PGCs也随着腔隙的缩小而向中央渗入,最终初生性腔消失。PGCs分化为精原细胞。部分精原细胞正处于分裂增殖期,并组成精小囊(Spermatogenic cyst),此时的原始性腺可以改称为精巢(图II:12)。精原细胞的核大,核膜明显,核仁1-2个,核外的细胞质少,着色
10、浅。精原细胞胞径均值为47.3umx35.5um,核径均值为23.9umx18.1um。体积略小于卵原细胞。,2.2 温度对性腺分化的影响,在不同水温中培育的蝌蚪,其生长速度差别很大,但都能正常发育。各实验组与对照组的成活率都在90%以上,无明显差异(P0105)。低温实验组181 蝌蚪孵化后12 d才出现生殖嵴,27 d原始性腺形成;50 d才开始性腺分化;65 d出现明显的精巢和卵巢结构。高温实验组30 1、32 1、34 1 在2 d出现生殖嵴,8-9 d时原始性腺形成,12-15 d卵巢分化,至17 d精巢分化。,在18 1水温中培育的蝌蚪有雌性化的趋势(P0101),随着培育水温的升
11、高,雄蛙数量显著增加,至34 1,雄性率达74.0%(P0101),有明显的雄性化趋势。此外,在幼蛙的性腺连续切片观察中,也发现一些性腺的结构异常。如有的精巢中央腔隙不完全消失,外形是精巢而内部结构却似卵巢(图II:14);有的个体出现三个性腺(图II:15);还有少数个体呈雌雄同体特征,一侧性腺呈精巢组织结构,另一侧则为卵巢结构(图II:16)。,对大多数两栖类来说,16-26 范围内,个体的雌、雄比例大约为1:1,而在极冷或极暖的温度条件下,个体性腺的分化可能会受到干扰,产生明显偏差的性比。本实验表明,在23-25自然水温下,17 d时,原始性腺形成,22 d 时,卵巢分化,34 d 时,
12、精巢分化。因此泽蛙性分化的敏感时期是在蝌蚪17-34 d 之间。在此期间对蝌蚪进行不同温度的培育,对其性腺分化有明显的影响。在23-25自然水温下培育,幼蛙的雌、雄比接近1:1(1:1.06);而在181水温培育下,幼蛙的雌性率明显偏高(1.83:1);如果培育的水温在30-34 范围内,雄性幼蛙的数量明显比雌性多。,实验表明,泽蛙的性决定属于温度依赖型的性决定(TSD),高温能诱导蝌蚪雄性化,这一结果与其它几种两栖类的研究结果相似。如美洲林蛙和冠欧螈,低温有利于胚胎的性腺雌性化,而高温有利于雄性化。但是在滞育小鲵,温度对性分化的影响则相反,高温促使性腺雌性化,雌性率可高达95.3%(Sakata et al.,2005)。因此,高温可以影响蛙的性腺分化,但是性腺是趋向雄性或雌性有种的差异。,外界温度的变化对于温度依赖型性决定的动物群体性别比例的稳定有重大影响。当前全球气候变暖,对于那些温度依赖型性决定的种类来说,可能是一种潜在的生殖威胁。泽蛙的性别分化属于温度依赖型性决定,其生殖周期跨越了炎热的夏季(每年的4月至9月),当前地球夏季气温持续升高,泽蛙的种群性比稳定也存在着潜在的威胁。,
