《肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范--标准征求意见稿.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范--标准征求意见稿.docx(9页珍藏版)》请在课桌文档上搜索。
1、ICS65.020.30CCSB44实验动物学会团体标准T/CALASxxx-202x实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范1.aboratoryanimal-TechnicalSpecificationforthepreparationandevaluationofanimalmodelsofpulmonaryhypertension(征求意见稿)202x-x-x 发布202-x-xx实施中国实验动物学会发布-J-Z-A刖百本文件按照GBZT1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别
2、专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位:湖南中医药大学、华中科技大学同济医学院、广州医科大学、湖南师范大学附属湖南省人民医院。本文件主要起草人:戴爱国、胡清华、王健、蒋永亮、胡瑞成、易健、谭骏岚。实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范1范围本标准描述了肺动脉高压大鼠模型的制备和评价方法。本标准适用于野百合碱(MCT)诱导、慢性缺氧诱导、香烟烟雾诱导、SUgen5416/缺氧(SuHx)诱导、MCT/缺氧诱导肺动脉高压动物模型的评价。2规范性
3、引用文件本标准引用的文件为现行有效的国家标准及行业标准。GB/T35892-2018实验动物福利伦理审查指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 肺动脉高压肺动脉富压(PUlmonaryhyPertenSion,PH)是指由多种异源性疾病(病因)和不同发病机制所致肺血管结构或功能改变,引起肺血管阻力和肺动脉压力升高的临床和病理生理综合征,继而发展成右心衰竭甚至死亡。3.2 动物模型在各种医学科学研究中建立的为阐明人类疾病的发生机制及建立预防、诊断和治疗方法而制作的具有人类疾病模拟表现的实验动物。4肺动脉高压动物模型制备技术要求1.1. 野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型4. 1.1实验原
4、理5. 野百合碱(monocrotaline,MCT)在经过大鼠肝脏细胞色素P450系统代谢后生成野百合碱毗咯,进而造成肺血管内皮细胞损伤和炎症,导致肺动脉高压的发生发展。6. 1.2实验材料需排除雌激素对实验模型的干扰,所以均选择雄性SD大鼠(下同)。多导生理检测仪、PE导管、BL-420F生物机能实验系统、TPl102电子天平、CulAS图像处理与分析系统、解剖用器械(直镣、弯镒、止血钳、眼科剪、组织剪等)、小动物超声仪、体视显微镜。肝素钠、野百合碱(MCT)、0.9%氯化钠注射液。4.1.3模型建立技术要求所有大鼠随机分为两组,即模型组和对照组。模型组:给予大鼠一次性腹腔注射(ip)MC
5、T,推荐注射剂量为60mgkg:对照组:一次性腹腔注射等体积的生理盐水,4周后进行相关指标检测。MCT注射剂量的注意事项:一般情况下,单次注射MeT(60-80mgkgT)足以诱导肺动脉富压的病理特征,降低MCT的剂量(20-40gkgT)相应会降低肺血管重塑的程度,使大鼠产生适应性右心室肥大,与人类肺动脉的逐渐加重相反,大鼠的肺动脉高压会在4周后逐渐自发逆转。值得注意的是大鼠在单次注射腹腔注射MCT的6-8周后死亡率很高。4.2.慢性缺箱诱导肺动脉高压动物模型4.2.1实验原理由于肺泡长期广泛缺氧导致肺小动脉收缩、肺动脉平滑肌增殖、肺血管炎症等造成肺血管重塑,导致肺动脉高压的发生发展。4.2
6、.2实验材料雄性SD大鼠。多导生理检测仪、PE导管、TPl102电子天平、CMlAS图像处理与分析系统、解剖用器械(直镒、弯镒、止血钳、眼科剪、组织剪)、小动物超声仪、体视显微镜、低氧舱。肝素钠、0.9%氯化钠注射液。4.2.3模型制备技术要求所有动物随机分为两组,即模型组和对照组。模型组:大鼠放入低氧舱(氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%),每天低氧处理8小时,不间断重复4周。对照组:老鼠放在在相同室内环境中,不做任何处理,自由饮食。所有动物都饲养在同一个房间内,暴露在相同的明暗循环和环境温度下,并被安置在标准的老鼠笼(三只大鼠/笼子)中,可以自由获取食物和水。4.3.Sugen5
7、416/缺辄(SuHx)诱导肺动脉高压动物模型4.3.1实验原理Sugen5416(SU5416)是VEGFR-2受体抑制剂,在慢性缺氧大鼠中,SU5416可诱导肺血管内皮细胞死亡和功能障碍,促进内皮细胞转化为凋亡抵抗表型,增殖的内皮细胞引起动脉管腔闭塞,导致严重的肺动脉高压发生。4.3.2实验材料雄性SD大鼠。多导生理检测仪、PE导管、TP1102电子天平、CMlAS图像处理与分析系统、解剖用器械(直锻、弯锻、止血钳、眼科剪、组织剪)、小动物超声仪、体视显微镜、低氧舱。肝素钠、SU5416、0.9%氯化钠注射液。4.3.3模型制备技术要求所有动物随机分为两组,即模型组和对照组。用拨甲基纤维素
8、(CMC)的稀释剂配备SU5416注射液。模型组:给予大鼠一次性皮下注射SU5416(20mgkg),并低氯(氧气浓度10%0.5斩湿度为60f0.5%)处理8小时,不间断重复3周。在21天结束时,将大鼠返回室内空气(正常氧)再持续2周。对照组:老鼠放在在相同室内环境中,不做任何处理,自由饮食。5周后进行相关指标检测。所有动物都饲养在同一个房间内,暴露在相同的明暗循环和环境温度下,并被安置在标准的老鼠笼(三只大鼠/笼子)中,可以自由获取食物和水。4.4香烟烟雾诱导肺动脉高压模型4.4.1实验原理吸烟者容易发生肺动脉高压,并且不少吸烟的慢性阻塞性肺疾病患者在患病初期,未发生明显缺氧时已存在肺小血
9、管重塑。因此,香烟烟雾可直接引起肺小血管重塑,导致肺动脉高压的发生发展。4.4.2实验材料雄性SD大鼠。多导生理检测仪、PE导管、TPllO2电子天平、CMlAS图像处理与分析系统、解剖用器械(直镒、弯锻、止血钳、眼科剪、组织剪)、小动物超声仪、体视显微镜、香烟烟雾染毒箱、烟雾探测器。肝素钠、0.9%氯化钠注射液、香烟。4.4.3模型制备技术要求所有动物随机分为两组,即模型组和对照组。吸烟模型组大鼠置于香烟烟雾染毒箱(需有通气孔)内接受香烟烟雾刺激,每天2次,每次燃12支香烟,维持箱内烟雾量lh。所用香烟规格为:烟气烟碱量0.6mg、焦油含量9mg、烟气一氧化碳量Unlg。为了避免缺氧对实验的
10、影响,同时需要监测箱内氟浓度(氯浓度维持在18-21%),基本可排除缺氧对本模型的影响。在箱内安装烟雾探测器,用于监测造模期间箱内CO浓度,CO浓度维持在800ToOOPPm左右为宜。每周造模5天,连续造模4个月后进行相关指标检测。4.5MCT/缺氧诱导肺动脉高压动物模型4. 5.1实验原理同4.1与4.2中的实验原理。5. 5.2实验材料雄性Wistar大鼠。多导生理检测仪、PE导管、TPllO2电子天平、CMlAS图像处理与分析系统、解剖用器械(直镒、弯镒、止血钳、眼科剪、组织剪)、小动物超声仪、体视显微镜、低氧舱。肝素钠、0.9%氯化钠注射液、MCTo6. 5.3模型制备技术要求所有动物
11、随机分为组,即模型组和对照组。模型组大鼠一次性腹腔注射(ip)60mgkgT的MCT后置于低氧舱(氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%),每天低氧处理8小时,不间断重复4周。对照组:老鼠放在在相同室内环境中,不做任何处理,自由饮食。所有动物都饲养在同一个房间内,暴露在相同的明暗循环和环境温度下,并被安置在标准的老鼠笼(三只大鼠/笼子)中,可以自由获取食物和水,4周后进行相关指标检测。5肺动脉高压动物模型模型评价技术要求5.1 模型的一般症状观察要求观察大鼠活动及呼吸情况,精神状态,毛发颜色,营养状态等,有无异常表现,并及时记录大鼠体质量变化和患病或死亡情况。5.2 模型心、肺血流动力学
12、检测5. 2.1具体检测指标a)右心室收缩压(RVSP)b)平均肺动脉压(mPP)c)三尖瓣瓣环收缩期位移(TAPSE)d)右心室舒张末期横径(RvEDD)e)右心室舒张末期纵径(RVEDL)f)右室舒张末横、纵径之比(RVEDD/RVEDL)j)肺动脉血流加速时间(PAAT)h)右心室游离壁厚度(RVFwT)5. 2.2检测技术要求5. 2.2.1超声心动图检测检查操作前准备:因为大鼠太大而无法在其清醒时手动约束,所以在进行超声心动图之前需对大鼠进行麻醉;使用3%异氟?烷吸入诱导麻醉,以IML5%异氟烷加100%氧气维持麻醉;使用金霉素软膏等或动物用软膏涂抹大鼠的眼睛,防止麻醉后干燥;使用脱
13、毛膏脱去大鼠胸部及右侧颈部的毛发:将动物放在手术平台上,保持仰卧位;下面放置一个加热垫,并设置加热水平以维持37-37.5C的体温(因为体温过低会导致明显的心动过缓,而体温过庙会导致明显的心动过速),操作过程中监测大鼠直肠温度;a)操作过程:检查部位涂布适量的耦合剂,用彩色多普勒超声诊断仪,配小动物探头(频率设置为25UHz),帧频设置为150帧/秒,行二维超声心动图、M型超声心动图和多普勒超声心动图检查,检测相关参数评估右室功能及反应肺动脉高压,检查参数使用VisualSonicsVevo770SyStenI设置。所有超声检测方法依据欧洲超声心动图协会指南要求进行。所有检测指标重复测量3次,
14、取平均值。RVEDD和RVEDL:采用二维超声心动图,舒张期于心尖四腔面测量RvEDD和RVEDL,并计算RVEDD/RVEDL;PT:脉冲多普勒取样线平行血流方向,肺动脉瓣水平记录肺动脉血流频谱,测得PAAT;TMPSE:2DM模式超声心动图中从心尖四腔切面测量的,将光标定位在靠近游离RV壁的外侧三尖瓣环上,并使其尽可能靠近心尖。RVEWT:在舒张末期,在胸骨旁短轴二尖瓣二维水平或胸骨旁长轴RV流出道水平的U模式下测量:b)结果判定:与对照组相比,模型组RVEDD、RVEDLRVEDD/RVEDL明显上升高,而PT与TMPSE明显下降(P0.05);7. 2.2.2右心导管法检测大鼠的RVS
15、P和InPAP操作步骤如下:a)右心导管的制备:取9cm的PE管,将其一端2Cnl处卷成圆形,通过酒精灯或水浴加热的方法,使其前段弯曲弧度固定成形。尽可能的使导管末端的弧度与右心室、肺动脉所形成的弧度相似。制备完成后,分别在距离末端5cm、6cm、7Cm处做标记,作为插管时判断位置之用。b)插管前准备:自制右心导管,浸泡在肝素生理盐水(100UmL)中,保持导管通畅:多导电生理仪参数设置:将压力传感器连接到输入通道1:在软件中,将通道1设置为压力,通道2设置为心率;要将单位转换为mmHg,记录基线轨迹,使用压力表手动执行压力校准基线(如果使用血压传感器和PE管),需在通道1下进行单位转换。C)
16、分离颈外静脉:将大鼠放置于体视显微镜下分离颈外静脉:取颈部正中偏右纵切口,在切口的每一侧放置一对牵开器,以充分暴露颈部区域;切除唾液腺,使用镜子暴露右颈外静脉,小心地将右颈外静脉与周围的结缔组织隔离开来;使用6.0缝合线对颈外静脉的远心端结扎,近心端做一松结以防止插管时血液流出过多。d)插管:用眼科剪在静脉中上1/3位置斜行剪开颈外静脉,用镒子稍提起近心端切口边缘,插入右心导管。插入时保持导管的弧向上。导管进入心脏前,要经过两次旋转:1)在腋静脉与颈外静脉交汇处,约在导管进入ICnl后,此时应轻左旋导管。2)在静脉进入胸腔处,导管共进入约1.5CnI时,此时应右旋导管。若导管进入心脏,可观察到
17、导管随心跳节律抖动,压力曲线由直线变呈有波形的曲线。这时,可将导管推进至7Cm标志处,然后再缓慢退出导管,并不断左右旋转,导管可进入右心室。一般插入2Cnr3CnI可到达右心房,4Cm可达右心室,4.5Cnr5CnI可进入肺动脉。同时,还应根据监视器显示的压力值大小与压力曲波形的变化来判断导管尖端的位置,并作相关记录。平均肺动脉压(mPP)=2/3舒张压+1/3收缩压e)结果判定:模型组大鼠的RVSP和mPAP显著高于对照组(P0.05),判定结果。7.3 右心肥厚指数及肺血管重塑指标检测7.4 .1心、肺组织标本获取技术要求大鼠在进行心、肺血流动力学检测后,放血处死大鼠,进行胸骨中线切开术以
18、暴露心脏和肺部;IOnd注射器抽吸无菌冷PBS,更换小针头,备用;手术剪剪开左心耳,镜子固定心尖部,IOml注射器穿刺右心室,以适当速度注射PBS,PBS通过右心室-肺动脉-肺静脉-左心房,将血液冲洗出来,待双肺变白,证明肺内血液基本冲洗干净;彻底离断肺门组织,取出双肺;离断升主动脉,取出心脏,生理盐水冲洗心脏。沿房室沟剪去左右心房和大血管,再沿室壁间沟将右心室(RV)游离壁分离,切开左心室(LV)游离壁。将分离的组织展平,并用漉纸吸尽其上的液体。分别对(LV),室间隔(三)和右心室(RV)进行称重。5. 3.2右心肥厚指数(RVHI)检测a)RVHl指数计算公式:RV/(LV+S)b)结果判
19、定:模型组大鼠右心肥大指数显著高于正常组(P0.05),判定结果。5.3.3肺血管结构及形态的组织病理学检测5.3.3.1肺动脉组织学评估:取左下肺组织,用含1%福尔马林+0.5%琼脂糖的PBS经气管充气,恒压20CniH2。,然后在10%福尔马林中性缓冲液中固定过夜,取5um厚的切片进行后续的分析。苏木素-伊红(HE)染色检测小鼠肺小血管病理变化。MaSSOn染色检测肺血管纤维化。光学显微镜下观察拍照,ImageJ测量分析血管直径25100UnI的肌性肺小动脉。W%=管壁面积/血管总面积XlOo船WT脏肺小动脉管壁厚度/动脉外径XlO0机5.3.3.2免疫组化检测肺动脉Q-SMA的表达:肺组
20、织切片经常规脱蜡至水,PBS缓冲液冲洗,H2O2阻断内源性过氧化氢酶,柠檬酸缓冲液进行抗原修复,滴加一抗Q-SMA(1:500)4C孵育过夜,PBS冲洗后分别滴加反应增强液、二抗,DAB染色,苏木精复染,饱和碳酸锂返蓝,梯度75%乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。显微镜于200倍镜下观察-SMA的表达。5 .3.3.3结果判定a)肺血管结构及形态改变:相比较正常组大鼠,模型组大鼠肺组织出现血管内皮细胞损伤,细胞分布不均,动脉管壁明显增厚,小动脉管腔狭窄,肌化明显,肺组织有大量炎性细胞浸润,肺血管密度变小。b)肺小动脉形态计量学改变:模型组大鼠WT%.WA魁交对照组明显升高(PV0.05),提示模型组大鼠小动脉管壁增厚,管腔缩小。C)肺组织MaSSOn染色:对照组大鼠肺组织无或极少有细丝状纤维沉积,肺结构清晰可见,排列规则;模型组大鼠肺组织形态紊乱、结构排列模糊、有大量蓝色纤维沉积、肺组织间隙严重充血。d)肺组织a-SMA蛋白表达:采用IHC评分标准,在200倍镜下观察各组组织aTMA染色情况,每张切片选取3个视野,以评价着色深浅程度及其面积计分。对照组细胞颜色着色浅且面积较小,蛋白表达量较低,IHC评分为阴性。模型组细胞着色较深,蛋白表达量高,IHC评分为阳性。6 .动物福利保障动物实验应符合GB/T35892-2018,并经过实验动物福利伦理委员会审批。