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1、类器官及器官芯片技术在体外胎盘模型构建中的研究进展2023摘要胎盘具有物质交换及屏障功能，对维持胎儿生长发育至关重要。胎盘功能异常与多种不良妊娠结局有关。现有的体外胎盘模型均存在一定局限性，无法满足研究需要。目前类器官及器官芯片技术发展迅速，在药物研发、基础医学研究等方面展示出了极大的应用前景。构建自真实胎盘的类器官在细胞表型、基因表达等方面均与源组织具有高度一致性。胎盘芯片可体外模拟胎盘屏障，并在药物的胎盘通透性研究中被广泛应用。构建胎盘类器官芯片，或构建包含胎盘、子宫内膜等成分的多器官芯片，对于生殖及围产医学领域的发展具有重要意义。胎盘是哺乳动物妊娠过程中特有的器官，负责母胎之间的物质交换
2、，并具备一定的屏障功能1o胎盘结构或功能异常被证实与多种不良妊娠结局有关，例如子痫前期、胎儿宫内生长受限等2-3,其对不同药物的通透性也直接关系到胎儿的安危4。因此充分研究胎盘的结构功能对产科领域至关重要。然而，二维胞培养模型5-6、动物模型7等传统模型无法充分模拟真实胎盘，可重复性较差，成本较高，而临床试验又存在伦理争议，均无法满足当前研究需要，故亟需建立新的体外胎盘模型。近年来迅速发展的类器官及器官芯片技术为新的体外胎盘模型建立提供了思路。类器官是由干细胞或祖细胞扩增并分化形成的三维胞团，具备一定的器官功能，与传统二维培养细胞相比，在形态及功能上均更接近人体组织8-9。器官芯片以微流控技术
3、为核心，通过精确控制微升级流体，可实现体外细胞的动态培养10。该两种新型胎盘体外模型已逐步被应用于胚胎植入11-12、药物胎盘通透性4,13等研究，很大程度上克服了传统研究方法的局限性，并规避了伦理问题，在生殖及围产医学领域具有良好的应用前景。一 .胎盘的发育过程胎盘形成可追溯到受精后67d的囊胚阶段14。囊胚分为滋养外胚层(trophectoderm,TE沐口内细胞团innercellmassfICM)TE由滋养细胞构成,其中细胞滋养层细胞(cytotrophoblastzCT)是未分化细胞，在整个孕期中持续增殖并分化成所有其他的滋养细胞类型。一部分CT合胞化形成合体滋养层细胞(Syncyt
4、iotrophoblast,ST)xST是完全分化的滋养细胞，介导母胎之间的物质转运，并分泌人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)等物质1；另一部分CT分化成绒毛外滋养层细胞(extravillouscytophotroblastrEVT),侵袭蜕膜、部分子宫肌层，侵袭并重铸子宫螺旋动脉1,12。3种滋养细胞构成2种功能不同的绒毛1：由内层CTx外层ST构成的漂浮绒毛,负责母胎之间的物质转运；由内层CTx末端EVT构成的锚定绒毛,负责将绒毛锚定于内膜，同时直接接触母体蜕膜中的免疫细胞，参与母胎之间的免疫耐受。在胎盘形成初期，仅由CT,ST构成的绒毛称
5、原始绒毛。随后来源于ICM的中胚层结构进入初级绒毛内部，形成次级绒毛。随后中胚层结构形成血管，形成三级绒毛。同时，子宫内膜蜕膜化，ICM发育形成胎儿、脐带和羊膜。羊膜、绒毛及底蜕膜共同组成完整胎盘14o根据滋养细胞侵入子宫内膜的程度，胎盘可分为三类7,上皮绒毛膜型：滋养细胞不侵入子宫内膜，母胎血液完全分离；内皮绒毛膜型：滋养细胞侵入内膜上皮及间质组织，胎盘绒毛接触母体毛细血管；血液绒毛膜型：滋养细胞直接接触母体血液（图1）。人类胎盘为血绒毛膜型。图1不同的胎敌类型二 .传统研究方法1 .体内胎盘模型：在常用实验动物中，羊胎盘为上皮绒毛膜型，猫胎盘为内皮绒毛膜型,仅啮齿类、灵长类动物胎盘为血绒毛
6、膜型7o在结构方面，以啮齿类动物中最常见的鼠为例，其胎盘绒毛末端具有3层滋养细胞，不同于人类的单层ST（图2A、B）。在功能方面，以葡萄糖转运为例，鼠胎盘主要依赖葡萄糖转运侬glucosetransporter,GLUT）3,而人胎盘主要依赖GLT115o灵长类动物胎盘绒毛末端为单层滋养细胞，与人最为接近。但其胎盘在激素分泌等方面仍与人类有一定差异，且实验成本昂贵16。可见体内胎盘模型无法满足当下的研究需要。图2双胎盘.胎盆类器官及胎盘芯片与人胎盘的对比A示限胎盘.血绒毛腴型.城E末端包含3层滋养细胞；H示人胎盘.Ifil绒E膜型,绒毛末端为单层滋冰细胞;C示胎盘类器官.外周为细胞滋养层细胞.
7、内部为合体滋养层细胞;D小胎盘器甘芯片,滋养细胞.半透胶-血管内皮细胞结构2 .离体胎盘模型：离体模型包括胎盘灌流模型和绒毛外植体模型7。胎盘灌流模型为建立体外循环的真实胎盘小叶，具有完整的胎盘结构，长期以来被认为是研究物质胎盘通透性的金标准17。但该模型均取自晚孕期胎盘，无法模拟妊娠早期胎盘形成及植入等过程，且标本获取困难，每个模型仅有数小时的有效使用时间，可重复性差。绒毛外植体模型为体外培养的绒毛组织，可取材自早孕期胎盘，在胎盘侵袭能力研究中有一定应用。但静态培养环境可导致滋养细胞失去部分正常表型7,故而该模型亦有较大局限性。3 .体外胎盘模型：体外胎盘模型的细胞来源包括绒毛膜癌细胞系、原
8、代滋养细胞及滋养层干细胞(trophoblaststemcellzTSC)7o目前已有超过20个滋养细胞系被构建18L但研究表明JAR.JEG-3细胞系在人白细胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)表达上与真实胎盘组织有所不同5,HTR-8细胞系侵袭能力与原代细胞存在差异12,可见细胞系并不能代表真实胎盘。原代细胞及TSC与真实胎盘差异较小，但在传统培养环境下原代细胞会迅速失去细胞表型。1998年TSC即被证实存在于胎盘外滋养层中19,直至2018年，Okae等20才成功从人类囊胚中提取出TSCo干细胞亦可从体细胞诱导而来，但人胚胎干细胞(embryonicstemcel
9、lzESC)和诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcellziPSC)均无法分化成滋养细胞。2020年LiU等21才首次成功使用体细胞重编程诱导获得了TSC,并证实其具有向ST、EVT分化的潜能。由此可见，体内、离体和体外三类传统研究模型均存在一定局限性，无法满足当前的研究需要。三.胎盘类器官1 .类器官的构建及培养体系的优化：上皮组织类器官可由3种细胞构建而成，即多能干细胞、组织碎片及组织中提取的具备分化潜能的单细胞8。2018年，Haider等22报道了首例胎盘类器官，同年Turco等5亦构建了胎盘类器官,2个团队使用的细胞均来自妊娠68周的人类早孕胎盘组织5,22
10、。尽管培养体系及操作细节有所不同，构建胎盘类器官的基本方法是一致的5,22:消化胎盘组织获得滋养细胞后，使用不含生长因子的Matrigel重悬细胞，并置于37OC环境中数分钟待Matrigel凝固，随后以含多种细胞因子的培养基包被Matrigelz常规培养。可见在胎盘类器官的构建中，Matrigel及细胞因子是培养体系的关键。Matrigel来源于鼠肉瘤组织,富含层粘连蛋白、IV型胶原等细胞外基质extracellularmatrixzECM)成分，广泛应用于各种类器官的培养23-24o而培养基中的细胞因子成分与干细胞的培养体系类似，包括纤维原细胞生长因子4(fibroblastgrowthf
11、actor4,FGF4)9,19、转化生长因子(transforminggrowthfactorzTGF)125x表皮生长因子(epidermalgrowthfactorzEGF)9,26及Wnt通路激动剂5,9,25等物质。这些物质与Wnt通路22、TGF-通路8,22、骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMP)通路27密切相关，在既往研究中被证实可促进包括TSC在内的细胞生长、增殖及分化。Turco等5逐一检验了12种促进上皮类器官增殖的物质，并从中筛选出了6种用于胎盘类器官的培养，分别为肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactorlHGF)、
12、烟酰胺、Y27632、BMP7x孕激素及前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)。在此基础上，主要成分为EGF.FGF.Wnt通路激动剂的滋养层类器官培养基(trophoblastorganoidmediumzT0M)被用于类器官的长期扩增,而主要成分为A83-01及NRG1的EVT分化培养基(EVTdifferentiationmediumzEVTM)被用于诱导类器官向EVT方向分化(表1)。Haider等22的研究亦证实，EGF、PGE2、A83-01对胎盘类器官生长具有促进作用，并提出R-脊椎蛋白(R-spondin1,RSP01)亦为维持类器官扩增、抑制分化所必需。表1
13、滋养层干细胞及胎盘类器官培养体系培养物种属细胞因子其他添加物细胞外基质TSC【鼠FGF4肝素EMFI细胞TSC(TXa)网鼠FGF4TGI,-l肝素【谷氨酰胺L-AA2P亚硒酸钠胰岛素碳酸氢钠HOH转铁蛋白氨酰胺MatrigelTSC人CHIR99021EGFA83-O1SB431542Y27632丙戊酸硫基乙醇FBSL-维生素CIlS-XBSA胶原IV类器官人CHIR99021EGF83-O1RSPOlHGFNogginPGE2N2B27谷氨酰胺HEPES缓冲液Matrigel类器官(TOM)人CHIB99021EGFA83-OIRSPOlFGF2HGFY27632PGE2N2B27N.乙酰
14、-L半胱氨酸I谷氨酰胺Matrigel类器官(EvTM)人83-O12-硫基乙醇BSAITS-XNRGlKnOCkOUI血清替代物Matrigel注:FGF4示纤维原细胞生长因子4；TGF-Bl示转化生长因子因；ECF示表皮生长因子；RSPOl示R-脊椎蛋白1;HCF示肝细胞生长因子；L-AA2P示L-抗坏血酸-2-磷酸镁；FBS示胎牛血清;BSA示牛血清门蛋n；PGE2示前列腺素E2；ITS-X示胰岛素-转铁蛋FI-硒-乙醉股；NRG示神经调节蛋AiTSC示滋养层干细胞;T()M示滋养层类器官培养基;I.VTM示EVT分化培养基;1示TX培养基去除FGF4、TGF-B1、肝素后即为诱导分化培
15、养基2 .胎盘类器官细胞成分的验证：类器官与原器官的一致性验证可分为细胞形态、分子标志、基因表达等几个方面。目前所报道的胎盘类器官均为实心类球形结构。类器官外层细胞均为单核，形态特征与CT细胞相符。内部细胞为多核，细胞表面有微绒毛形成，胞内可见丰富的分泌细胞器及分泌囊泡,这些特征与ST细胞相符5,22,提示在类器官的中心发生了CT细胞的融合分化(图2C)。既往研究证实ERRBxCDX2、FGFR2xAP-2xGATA3等转录因子在TSC及高增殖活性的CT细胞中高表达19-20,25,28;基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinases2xMMP2)xHLA-G等与ECMx胶
16、原形成相关基因在EVT中高表达20;而绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotrophin,CG)aCGs妊娠特异性糖蛋白1(pregnancyspecificglycoprotein1,PSG1)、神经胶质细胞缺失因子1(glialcellmissing1,GCM1)等雷体激素、肽类激素相关基因在ST细胞中高表达20。以上分子常被用于免疫荧光及免疫组织化学检测，以验证类器官与原器官的一致性。Haider等22对比类器官与早孕胎盘后观察到，1型肝细胞生长因子激活剂抑制因子(hepatocytegrowthfactoractivatorinhibitortype1,HAI1)、CDX2
17、.TP63.AP-2.GATA3高表达于胎盘类器官的表面，而在早孕胎盘中则高表达于绒毛内部。同时,GCMkCG,多聚(U-)特异性核糖核酸内切酶poly(U)-specificendoribonuclease,ENDOU等分子表达于类器官中心及胎盘绒毛外层。该结果与细胞形态共同证实：类器官的细胞分布与胎盘绒毛相反。Turco等5的研究亦显示，与细胞增殖有关的分子Ki67xE-cadherin及AP-2高表达于类器官表面及早孕胎盘绒毛中心，提示该胎盘类器官同样存在结构反向现象。尽管存在结构异常，研究者仍从不同角度证实了类器官与胎盘绒毛的一致性。Turco等5使用流式荧光分选技术比较了类器官、胎盘
18、组织、正G-3细胞系及蜕膜组织，并证实类器官最为接近胎盘组织，并与细胞系及蜕膜明显不同。同时其观察到，不同胎盘来源的类器官之间HLA-I分子表达模式接近，而正G-3细胞表达模式与类器官则明显不同。在随后的全基因组测序中，类器官亦表现出了与胎盘绒毛的高度一致性。Haider等22通过近端ELF5基因启动子区域的甲基化检测，从表观遗传学的角度证实类器官与CT细胞更为接近，且与胎盘中纤维原细胞存在明显差异。在类器官的成分验证方面，Turco等5提出了4个验证标准：高表达GATA3xKRT7、EGFKTFAP2A和TFAP2C:不表达HLA-I分子；表达ELF5且其启动子区域低甲基化；19号染色体m很
19、NA簇表达水平不低于绒癌细胞系JEG-3和JARo但目前胎盘类器官的相关研究较少，该标准并未经过充分的研究检验。3 .胎盘类器官的局限性：尽管类器官技术克服了二维细胞培养的诸多缺陷，但培养环境为静态，仍然存在物质交换不充分、缺乏机械刺激等问题。除此之外，真实母-胎界面包含内皮细胞、蜕膜细胞、免疫细胞等多种成分2,而目前的胎盘类器官均为单一滋养细胞成分5z22o研究表明，真实胎盘中的ST、EVT细胞仍可进一步细分为多种亚型,且同一细胞类型在不同的妊娠时期具有不同的特征29Liu等29使用单细胞测序观察到，早孕胎盘EVT可分为3个亚群，而中孕胎盘EVT可分为2个亚群，其在绒毛细胞柱中的分布、基因表
20、达及细胞功能均有不同。而类器官虽可在体外诱导下分化形成ST、EVT,但其是否会进一步分化产生多种亚型，在长期扩增过程中细胞特征是否会发生变化，目前尚缺乏足够认知。另外，不同团队构建的胎盘类器官均存在反向极化现象，该现象在小肠30,子宫内膜类器官26中均有发现，具体原因不明。但在Muoth等31构建的胎盘微组织模型中,内层为绒毛间质纤维原细胞形成的细胞团，外层为BeWo细胞,该模型中的BeWo细胞具有正常的极化方向。类似地,在Abbas等32使用基质细胞、上皮细胞构建的子宫内膜类器官中，内层为基质细胞，外层为上皮细胞，该上皮细胞也具有正常的极化方向。Abbas等32提出，上皮细胞的极化与ECM信
21、号有关。在常规的类器官培养体系中，模拟ECM成分的Matrigel包裹于上皮细胞周围，导致细胞向相反方向，即类器官的中心发生异常极化。真实胎盘绒毛除滋养细胞外仍包含血管等间质成分2,而Matrigel为鼠肉瘤来源的水凝胶23,与真实人体ECM并不等同，因此在构建类器官过程中纳入间质成分或可进一步优化培养体系，解决滋养细胞异常极化的问题，更好地模拟真实胎盘。四.胎盘器官芯片1.芯片的构建：在人胎盘绒毛末端，单层滋养细胞直接接触母体血液，绒毛内部包含胎儿毛细血管，母胎血液之间的单层滋养细胞、单层血管内皮细胞及中间的基质成分共同构成胎盘屏障1,7。与胎盘类器官单纯模拟绒毛结构不同，胎盘芯片更多用于对
22、胎盘功能、行为的模拟,如胎盘屏障及胎盘植入。2016年，Lee等10首次报道了胎盘器官芯片的构建。与其他器官芯片的结构类似，该胎盘芯片由上下两个平行的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)通道构成，中间以玻璃化的I型胶原隔开。以纤连蛋白、明胶分别包被胶原膜的上、下层后，分别接种人原代脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)和绒癌细胞系JEG-3,双层细胞与中间的胶原形成夹心结构(图2D)。目前所有的胎盘芯片均使用PDMS作为构建材料，以滋养细胞-半透膜-血管内皮细胞结构模拟胎盘33,仅在细胞种类、半透膜材料方
23、面有一定差异。目前报道的胎儿界面均使用原代内皮细胞模拟，以HUVEC最常见4,10,34-36,也可使用人绒毛膜毛细血管内皮humanprimaryvillousendothelialcells,HPVEC)37o早期胎盘芯片的母体界面均为滋养细胞系，如Mosavati等38、Pemathilaka等13、Mandt等34使用的BeWo细胞zLee等10使用的JEG-3细胞。2020年，Park等12使用来自早期妊娠组织的原代EVT细胞及子宫内膜原代内皮细胞成功构建植入芯片(implantation-on-a-chip),并证实原代细胞在模拟胎盘侵袭方面优于HTR-8滋养细胞系。可以推测，原代
24、滋养细胞将逐渐取代细胞系，成为构建胎盘芯片的更优选。芯片中的半透膜材料可为聚碳酸酯膜4,37、玻璃化胶原膜10,39、聚合材料GeIMOD-AEMA34.Matrigel与胶原的混合物12等，其上包被的明胶10z34x胶原40等水凝胶可促进细胞黏附及物质交换。早期的半透膜通常只用于隔开2层细胞、模拟ECM,但近期的研究开始在凝胶中引入细胞成分以探究细胞间的相互作用，或使用更加复杂的凝胶成分模拟组织的生物力学特性。如Park团队在Matrigel及I型胶原形成的凝胶中加入了原代蜕膜基质细胞(decidualizedstromalcell,DSC)x子宫自然杀伤(uterinenaturalkil
25、ler,uNK)细胞，或二者的混合，实现了3种甚至4种细胞的共培养。并发现在模拟的ECM环境中，DSC及NK细胞不仅可存活并保持其特征,还可影响EVT的侵袭12。Govindasamy等11使用了甲基丙烯酸酯型葡聚糖(methacrylatedextran,DexMA)成分的水凝胶模拟蜕膜，其中包含可被MMP降解的肽和利于胚胎黏附的肽，在生物力学特性、可降解性、黏附性方面均接近真实蜕膜。在该凝胶中，埋植成管的小鼠脑内皮细胞与小鼠胚胎可实现共培养。2 .胎盘芯片中细胞特征的验证：尽管构建胎盘芯片多使用滋养细胞系，但仍可通过检测滋养细胞的特征，如细胞融合、微绒毛形成及hCG分泌来验证芯片对真实胎盘
26、的模拟。滋养细胞融合的机制尚未明确,但forskolin被证实可诱导滋养细胞的融合20Blundell等4,37使用forskolin处理胎盘芯片中的BeWo细胞后，细胞核出现聚集，部分细胞间连接消失，细胞通道流出液中hCG浓度升高，提示BeWo细胞发生了融合。尽管细胞间连接消失，但芯片的屏障功能并未受损，反而出现一定程度的增强，这一过程与体内胎盘的变化相符。在真实胎盘界面，滋养细胞膜表面的大量微绒毛可扩大与母体血液的接触面积，并与多种膜转运体、细胞骨架蛋白及酶的极化分布有关，是物质转运能力的重要结构基础1。Miura等39证实，流体剪切力(fluidsheartrigger,FSS)参与Be
27、Wo细胞微绒毛的形成与维持，并可影响GLUT1在细胞中的分布。在静态环境下，GLUT1分布在细胞核旁的囊泡中,而在FSS刺激下,BeWo细胞内部发生细胞骨架重构，随即在细胞顶端出现GLUT1聚集及微绒毛形成,而该分布特点与体内滋养细胞相符。Blundell等37对比了芯片与Transwell小室中的BeWo细胞，结果显示，芯片中的细胞膜表面微绒毛致密，而Transwell小室中的细胞表面微绒毛稀疏。Zhu等35亦报道，与静态培养相比，胎盘芯片中的BeWo细胞表面有更多的微绒毛，并存在GLUT1的极化分布。3 .胎盘芯片的屏障功能验证：完整的细胞覆盖及紧密的细胞间连接是形成胎盘屏障的物质基础。E
28、-钙黏蛋白是滋养细胞间连接的主要物质，VE-钙黏蛋白是上皮细胞间连接的主要物质37。目前通常使用免疫荧光染色验证细胞间连接的形成，并明确细胞是否完整覆盖半透膜。免疫荧光的强度可反映屏障功能的强弱。在Yin等36的胎盘通透性研究中，虽未发现纳米微粒(nanoparticles,NP)通过胎盘屏障，但荧光强度在NP暴露后减弱；另外，芯片中的细胞在NP浓度较低时虽具有正常活性，但细胞间连接变弱，推测在出现不良刺激时，细胞间连接的瓦解要早于细胞活性的下降。渗透实验为检测胎盘屏障功能的主要方法。将荧光标记的不同相对分子质量物质加入母体通道后，可通过检测胎儿通道的荧光强度来评估屏障的通透性。葡聚糖（相对分
29、子质量10000-200000）是检验屏障通透性最常用的物质37-38,41,部分研究亦使用肝素或菊粉4。以上均为大分子物质，无法通过正常胎盘屏障及结构完整的胎盘芯片。核黄素（相对分子质量350000）是检验屏障通透性常用的小分子物质，Mandt等34的研究证实了胎盘芯片对小分子物质具有半透性，并进一步证明屏障通透性与双层细胞间的多孔膜厚度无关。免疫荧光染色与渗透实验均会破坏细胞屏障，而跨膜电阻（trans-epithelialelectricalresistance,TEER）检测可无创评估胎盘屏障完整性。Schuller等41使用二氧化锢、二氧化钛、二氧化锌3种纳米微粒处理芯片中的单层Be
30、Wo细胞，通过与芯片相连的生物传感器检测交流电场中离子的跨细胞屏障运动，根据所测TEER评估细胞屏障的强度。结果显示，仅二氧化锌暴露会显著降低细胞屏障强度，并以荧光葡聚糖渗透实验进一步验证了这一结论。在Ferraz等6利用牛输卵管芯片体外模拟受精过程的研究中，亦采用了TEER检测评估了输卵管上皮屏障的完整性。但目前尚未见到检测双层细胞屏障TEER的报道。4.胎盘芯片在物质跨胎盘转运研究中的应用：葡萄糖的跨胎盘转运对维持胎儿生长至关重要，因此针对葡萄糖的研究最为充分，且常被用于验证芯片对胎盘界面的模拟能力。多项胎盘芯片研究均显示，单层细胞的葡萄糖通透性高于双层细胞，且上皮细胞比滋养细胞(包括JE
31、G-3及BeWo细胞府更高的葡萄糖通透性10,37-38o这提示葡萄糖跨胎盘转运的关键在于滋养细胞。Miura等39报道在FSS环境下葡萄糖的跨芯片转运增加与GLUT1的极化分布相吻合。Blundell等37定量检测了胎盘芯片与Transwell模型的葡萄糖转运，结果显示二者转运率分别为34.8%及22.5%,前者符合离体胎盘灌流实验所报道的数据42,而后者则明显偏低。鉴于目前离体胎盘灌流实验仍为胎盘物质通透性检验的金标准17,故Blundell等37认为胎盘芯片比Transwell模型更能模拟真实的胎盘功能。目前胎盘芯片已被广泛用于药物的跨胎盘转运研究中。Blundell等4利用胎盘芯片检测
32、了格列本版的跨胎盘转运。其证实，胎盘芯片中的BeWo细胞及体内胎盘中的滋养细胞均存在乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein,BCRP)的极化分布，该蛋白通过主动转运的方式，将格列本版从胎儿面向母体面转运，阻止了母血中的格列本版通过胎盘。Pemathilaka等13利用胎盘芯片检测了咖啡因的跨胎盘转运，结果显示胎盘芯片对咖啡因具有一定的屏障作用。与不含细胞的对照组相比，芯片中胎儿面咖啡因浓度仅为对照组的18.8%,为母体面浓度的2.1%同时其观察到咖啡因的跨胎盘屏障转运随时间延长而增加，但在5-7.5h后浓度稳定。Yin等36使用胎盘芯片研究了母体二氧化钛NP
33、暴露对胎盘屏障结构和功能的影响。尽管未观察到NP通过胎盘屏障进入胎儿面，但NP可弥散进入ECM,高浓度NP可同时增加BeWo、HUVEC的活性氧自由基表达，并促进BeWo细胞的死亡。低浓度NP促进了细胞间连接的瓦解,增加了胎盘屏障的通透性。故其认为NP虽不能透过胎盘屏障，但仍对胎盘功能有潜在危害。Zhu等35使用大肠杆菌感染胎盘芯片的母-胎界面，结果显示尽管细菌无法穿透胎盘屏障，但可使滋养细胞及内皮细胞释放炎症因子，从而导致大量细胞死亡及细胞间连接破坏，证实了感染可导致胎盘屏障受损，诱发早产。5.胎盘芯片对胚胎植入的模拟：除屏障外，侵袭、植入亦为胎盘的关键功能，该过程异常可导致妊娠失败。早期的
34、胎盘芯片在结构及功能上均更接近晚孕胎盘，无法用于研究早期胎盘的生物学行为。2017年，Abbas等43在芯片中共培养了来源于妊娠组织的原代滋养细胞及蜕膜NK细胞，并检测到活化的蜕膜NK细胞所分泌的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)可增强EVT细胞的侵袭、运动能力，并可影响其侵袭方向。虽然该体外培养系统并非严格意义上的胎盘芯片，且分离自蜕膜的NK细胞已与胚胎发生交流，与真实植入时胚胎先接触NK细胞再发生侵袭的过程不完全相符，但该模型仍实现了对早期胎盘植入过程的模拟及探索。在2020年Park团队报
35、道的植入芯片中，用于模拟母体界面的内皮细胞、DSC及NK细胞均来源于妊娠前内膜，这些细胞尚未与胚胎接触，最大程度地还原了真实的植入过程。在该芯片中，内皮细胞及UNK细胞可促进EVT侵袭，而DSC细胞可抑制EVT侵袭12。6.胎盘器官芯片的局限性：胎盘芯片实现了滋养细胞、内皮细胞的动态共培养，在胎盘物质转运的模拟上优于胎盘灌流17、Transwell37等传统模型。但多数胎盘芯片使用滋养细胞系,其与原代细胞在基因表达及细胞行为上的差异成为其局限性之T5J2o但随着原代细胞构建的胎盘芯片逐渐问世12,该局限正逐渐被克服。在真实母-胎界面中包含NK细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞，绒毛间质中包含间充质细
36、胞、网状细胞、周细胞等成分14。有些细胞在胎盘植入过程中发挥重要作用，蜕膜基质细胞、NK细胞已被一些研究纳入培养体系12,43。尽管芯片的细胞成分逐渐丰富，但依然无法完全模拟真实母-胎界面。另外，尽管实现了动态培养，芯片中的细胞依然为二维平面结构，与在体生理状态并不相符。最后，目前的胎盘芯片均使用PDMS材料33,尽管其具备透气、透明、可塑性高等优点，但会吸收性激素等疏水小分子。性激素在妊娠过程中发挥重要作用，因此如要构建含有性激素的培养体系，需寻找更合适的芯片材料。五 .类器官芯片及多器官芯片如上所述，类器官虽具有三维结构，但培养体系为静态；而器官芯片虽实现了动态培养，但细胞不具备三维结构。
37、近年来，结合了二者优势的类器官芯片技术迅速发展，为更加真实地模拟母-胎界面提供了新思路。该技术以微流控技术动态培养类器官，可更好地模拟体内环境,并在产科研究中崭露头角。例如，Wang等44和Cui等45使用人诱导多能干细胞构建了胎儿脑类器官芯片，体外重现了早期胚胎脑发育过程，并检测了尼古丁、丙戊酸等物质暴露对胎儿脑发育的影响。Govindasamy等11在三维芯片中共培养早期小鼠囊胚和成管的小鼠脑内皮细胞，结果显示，囊胚外层的滋养细胞形成钱链状假足向内皮细胞方向侵袭，同时表达血管生成相关基因，体外再现了滋养细胞与内皮细胞的互动。尽管该研究使用的囊胚并非类器官，但可推测该模型亦可用于构建胎盘类器
38、官芯片，从而更加真实地模拟复杂的母-胎界面。随着技术发展，在一个芯片中同时模拟多个器官的多器官芯片逐步成为研究热点。例如Maschmeyer等46构建了包含小肠、肝、肾、皮肤的多器官芯片，模拟了药物体内代谢的完整过程。内皮细胞及芯片管道构建的血管网络可将多个器官相连，模拟血液循环47o妊娠过程中存在胎盘、蜕膜及胎儿的互相作用，多器官芯片技术有望用于体外重现母-胎界面的细胞、器官交流。六 .结论与展望胎盘类器官构建自真实胎盘组织，无种属差异性，与源组织差异小，且具备长期扩增的能力，可极大地降低实验成本，增加可重复性，同时避免了伦理争议。类器官中的CT细胞可具备向不同方向分化的潜力，并在体外环境下
39、表现出侵袭行为，在研究滋养细胞分化机制、侵袭能力方面应具有一定潜力。但必须指出的是，目前的胎盘类器官均为单一滋养细胞成分，且ST细胞位于类器官内部，细胞成分与极化方向均与真实绒毛不同5,22。纳入基质细胞、血管内皮细胞，构建多细胞成分的胎盘类器官或有望解决这一问题，更好地模拟体内绒毛。胎盘芯片实现了细胞的动态培养，避免了静态培养导致细胞特征丢失的弊端，同时在物质通透性上更接近真实胎盘屏障，因此在孕期物质暴露、孕期用药安全性研究领域具有极大潜力。随着技术的进步，芯片中可同时培养多种细胞，使进一步模拟复杂的母-胎界面成为可能。在芯片中可模拟胚胎植入等过程112,使细胞间交流变得可视化，有利于研究母
40、-胎界面的细胞交流。然而芯片中的细胞仍为二维结构，且制造芯片的绝对主流材料PDMS为疏水性，使得培养体系中无法加入疏水小分子，此均为胎盘芯片的局限性。类器官芯片技术结合了三维细胞培养和微流控技术的优点，最大程度模拟了体内的真实环境。可以设想，如成功构建胎盘类器官芯片，可同时实现对绒毛立体结构、母体血流等因素的模拟，很大程度上克服了胎盘类器官和胎盘芯片的缺点。另外，多器官芯片技术有望实现对胎盘、蜕膜、早期胚胎组织甚至其他人体器官的共同培养，可更加真实地体外重现妊娠环境，进一步研究妊娠过程中的器官交流。参考文献1GudeNMrRobertsCTrKalionisB.etal.Growthandfu
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