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1、耳鼻咽喉科中耳乳突胆脂瘤治疗常规中耳乳突胆脂瘤是临床上常见的耳部疾病之一。具有慢性进行性、破坏性和难治性等特点。由于病变具有侵袭性,常常破坏听小骨，引起不同程度的听力障碍，而且还可引起各种颅内、外并发症，如眩晕、面神经瘫痪、脑脓肿等。严重者可能导致死亡。“胆脂瘤”的概念于1838年由德国生理学家JohannesMfieller首次提出，此后关于中耳乳突胆脂瘤的报道越来越多。中耳乳突胆脂瘤的组织病理学特征是中耳乳突内存在高度增殖的角化鳞状上皮和邻近骨质的吸收、破坏。显微光镜下的胆脂瘤呈一种复层鳞状上皮，由基底层、棘层、颗粒层和角质层组成，后者占95%,从基底层到角质层是角质细胞增殖、分化、移动和
2、脱落的过程，并处于过度增殖状态,这与正常皮肤表皮增殖完全不同。非常遗憾的是，尽管历经百余年的研究，但迄今为止,中耳乳突胆脂瘤的发病机制仍存在诸多不明确的问题。仅关于胆脂瘤形成这一问题，目前就有多种假说，例如先天性胚胎上皮残留学说、袋装内陷学说、上皮移行学说和基质细胞增殖学说等。随着20世纪末各种免疫学技术的不断发展并应用于中耳乳突胆脂瘤病因机制的研究，免疫学因素在中耳胆脂瘤发生、发展中的作用越来越受到各国学者的重视。目前已有较多的证据支持中耳乳突胆脂瘤的发生和发展是机体防御慢性炎症反应所引起的一系列免疫应答反应的结果，表现为中耳腔内存在高度增殖的角化鳞状上皮、程序性角质细胞凋亡、腔内角化碎屑堆
3、积和继之的周围骨质破坏。最近，WelkoborskyHJ从免疫学角度对中耳乳突胆脂瘤的发病机制作了如下表述：首先是咽鼓管功能障碍引起局部内陷袋形成，继之局部感染导致黏膜自洁功能障碍，使细胞碎片和角化细胞在内陷袋中逐渐积聚，后者进而引起多种免疫细胞（包含朗格汉斯细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞）迁徙，导致上皮细胞的增殖、角化和成熟循环失衡，以及细胞凋亡延长，上述病理改变均导致自洁功能进一步紊乱。此外，炎症刺激在引起上皮增殖的同时，还引起组织溶解酶和细胞因子的分泌增加，加之，内陷袋中的细菌产生的一些抗原，也继而活化各种不同的组织溶解酶和细胞因子，如ICAM.RANKL.IL-KIL-2、IL-6、MMP
4、-2和MMP-9等,这些酶及细胞因子刺激和活化破骨细胞，引起细胞外骨基质退化和增殖，使疾病侵袭进展。本文从胆脂瘤上皮细胞过度增殖、骨质破坏吸收机制、细胞凋亡基因和信号转导的调控，以及胆脂瘤与中耳和全身炎症反应的关系等方面阐述中耳乳突胆脂瘤的免疫学机制。一、胆脂瘤上皮细胞过度增殖的免疫学机制细胞增殖在中耳胆脂瘤形成的过程中起着重要作用。近20年来，通过对细胞增殖标志物及细胞生长因子等在中耳胆脂瘤上皮的研究从免疫学的角度进一步证实其具有过度增殖的特性。然而需要指出，中耳胆脂瘤上皮细胞的过度增殖与恶性肿瘤不同。中耳胆脂瘤的增殖并不是无限制的，其细胞仍具有正常凋亡的能力，这与肿瘤细胞的增殖有着本质的区
5、别。在某些基因、蛋白或细胞因子等调控下，胆脂瘤上皮细胞的凋亡能力会显著增强，并导致了上皮细胞的异常增殖被增强的细胞凋亡所抑制。国内有学者应用免疫组化染色、链球菌抗生物素蛋白一生物素复合物（SABC）技术及DNA末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）,对20例胆脂瘤上皮组织及10例正常外耳道皮肤组织样本进行研究发现，尽管胆脂瘤上皮和正常外耳道上皮中凋亡细胞均出现于颗粒层和棘细胞层，但前者的凋亡率明显高于后者，说明胆脂瘤上皮具有很强的增生能力，也同样具有很强的凋亡能力。另外，从染色体水平来看，胆脂瘤也无明显的染色体变异，无恶变倾向。（一）细胞增殖标志物的研究反映细胞增殖状态的度量指标
6、如细胞角蛋白、细胞增生核抗原67和增殖细胞核抗原等，在胆脂瘤上皮中的表达均显著增加。1 .细胞角蛋白细胞角蛋白（CK）是一类由细胞角蛋白基因编码的水溶性聚合多肽，分布于大多数上皮和间皮细胞源性的细胞中，是上皮分化、增殖的重要标志物。CK的表达与上皮细胞的紊乱、上皮增殖性疾病和肿瘤相关。在胆脂瘤上皮活跃增殖中，CK5、CK6是基底细胞增殖的标志，CK13是上皮分化的标志，CK16是上皮增殖的标志。早有研究发现胆脂瘤上皮有CK16和CK13的表达，而外耳道上皮仅有CK13表达。CK16的表达主要位于邻近外耳道的胆脂瘤复层上皮、外耳道复层上皮和鼓膜，而CK13的表达则位于胆脂瘤的基底层。利用凝胶电泳
7、技术也证实CK13,CK16存在于中耳胆脂瘤上皮。免疫组化方法亦证明CK16表达于胆脂瘤上皮的基底上层细胞，且在胆脂瘤上皮厚的区域明显强于上皮薄的区域，而CKI3只出现在没有CKI6表达区域的基底细胞层。利用三种中耳胆脂瘤动物模型（外耳道结扎组、袋状内陷组、炎症组）研究CK在胆脂瘤形成中的作用，发现CK1、CK5、CK6、CKlO在外耳道结扎组表达增强，而作为细胞增殖标志的CK13,CK16则在袋状内陷组表达增强，同时还显示CK5、CK6、CKI3、CK16的表达增强与胆脂瘤的进程相关。上述研究结果说明CK的表达与胆脂瘤上皮的增殖、迁移有密切的关系。2 .细胞增生核抗原67细胞增生核抗原67是
8、一种与细胞密切相关的核抗原。用免疫组化方法观察K167的抗原表达已经证实其存在于细胞周期的Gl后期、S期、G2期、M期，而不存在于静止期的Go细胞，其功能与染色质和细胞有丝分裂有关。Kuczkowski等通过51例胆脂瘤及6例正常皮肤进行免疫组化及聚合酶链反应(PCR)等方法，发现Ki67在中耳胆脂瘤中有高表达。针对K167抗原决定簇的单克隆抗体MIBl是目前最好的细胞增殖标记。有研究采用单克隆抗体MIBl免疫染色，对比观察了胆脂瘤和正常外耳道皮肤上皮细胞，结果发现正常外耳道皮肤标本的MIBl阳性增殖细胞主要见于基底层，图像分析表明其平均MIBl积分(MlBl阳性细胞数与总细胞数的比值)是7.
9、6%2.2%;而在中耳胆脂瘤标本则均在上皮基底细胞层角玩细胞中显示细胞增殖标志物的阳性免疫活性，其MIBl积分是17.4%8.9%,且在增殖上皮区表现出不均匀性，是正常外耳道上皮的2.3倍。MIBl阳性细胞不仅出现于中耳胆脂瘤上皮的基底层，在基底层以上的细胞层也存在，证实中耳胆脂瘤是一种过度增殖性疾病。3,增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(PCNA)是出现于细胞周期GlS期的细胞核中的蛋白质，参与细胞核DNA合成与细胞增殖，可用于评价细胞的增殖能力。研究发现，胆脂瘤组织中PCNA阳性细胞数显著高于正常皮肤。应用抗PCNA抗体的免疫组化方法观察外耳道骨部皮肤和胆脂瘤表皮PCNA染色差异性，以及胆脂瘤
10、表皮下炎性细胞浸润对PCNA染色的影响，结果显示在胆脂瘤上皮中，不但在基底细胞层和基底上细胞层，而且更靠近表面的细胞层，均发现高水平的PCNA染色，炎症越重，阳性细胞的位置也越靠上，且纤维细胞增殖越活跃，PCNA阳性率越高。表明上皮下炎性细胞浸润严重的区域，细胞增殖能力越高。这种微环境差异可能明显影响胆脂瘤上皮的增殖能力。（二）细胞生长因子的研究通过对胆脂瘤的组织病理学研究发现，胆脂瘤的增殖是血管生成依赖性的，与微血管供养作用的内皮细胞分泌的多种促生长因子有关。其中肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和角质细胞生长因子在诱导血管形成中有很重要的作用。L肝细胞生长因子（HGF）HGF阳性产物定位于细
11、胞的胞质，胞核无着色。健康人外耳道皮肤上皮层中，HGF阳性表达主要位于基底层的棘细胞、颗粒细胞层中，密度低，淡棕色。而在胆脂瘤上皮中HGF表达位于上皮全层，胆脂瘤上皮下的淋巴细胞、间质中的纤维细胞和血管内皮细胞亦有阳性表达，表达密度高，呈棕色强阳性。近年国内有研究采用免疫组化SP法检测34例中耳胆脂瘤标本的HGF表达，结果显示HGF主要表达于胆脂瘤上皮层和上皮下基质细胞。在正常外耳道皮肤中仅表达于上皮基底层。胆脂瘤基质周围微血管计数均数高于正常外耳道皮肤，提示HGF诱导的新生血管形成可能是中耳胆脂瘤侵蚀性行为的主要原因之一。2 .血管内皮生长因子（VEGF）VEGF阳性产物也定位于细胞的胞质，
12、胞核无着色。健康人外耳道皮肤上皮下和血管基底膜可见VEGF弱阳性表达，而在胆脂瘤上皮基底部和超过基底部胆脂瘤角质细胞中，VEGF表达呈强阳性。在内皮细胞和邻近的炎性上皮下结缔组织基质细胞中VEGF染色强度增加。大量免疫浸润细胞、假单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞的胞质内可见抗VEGF抗体的弱阳性表达。3 .角质细胞生长因子(KGF)KGF为中胚层细胞衍生的旁分泌生长因子，其可特异性地刺激上皮细胞增生。KGF在胆脂瘤上皮中呈强阳性表达，且从基底层向角质层染色有逐渐增强的趋势，间质中可见散在的阳性细胞。在正常外耳道皮肤标本，KGF主要表现为间质中稀疏不均的弱阳性表达，在上皮细胞则不表达。胆脂瘤上皮和正
13、常外耳道皮肤的KGF阳性表达率之间差异有显著性意义，且在胆脂瘤上皮中KGF与K167表达呈正相关。4 .表皮生长因子早年已通过对表皮生长因子受体(EGFR)的研究发现，表皮生长因子受体在胆脂瘤中亦有异常表达，表明了胆脂瘤上皮的高度增殖性。5 .炎症调节因子及细胞间通信分子近年来对炎症调节因子及细胞间通信分子的研究也提供了一些有关胆脂瘤生长的免疫因素的资料。细胞分裂素及细胞黏附分子在白细胞通过末梢血管及组织的游走过程中起中心作用，并可导致淋巴细胞和角质细胞的增殖。有研究表明细胞间黏附分子-1（ICAM-I）和内皮细胞起源的白细胞黏附分子-1（ELAM-I）在胆脂瘤周边基质的内皮细胞呈明显表达，I
14、CAM-I在胆脂瘤基质底层的表达提示在胆脂瘤的上皮-基质连接处可能是免疫反应源，干扰素-Y受体（IFN-YR）在胆脂瘤基质的底层表达，表皮生长因子受体（EGFR）在胆脂瘤基质的所有层表达，胆脂瘤周边基质中可测到T细胞和B细胞，这些均提示胆脂瘤上皮细胞处于激活状态，它们的增殖受细胞分裂素及细胞黏附分子调节。有研究表明多种细胞分裂素（如HL-La、TGF-a.KGF）参与了这些物质的积聚性表达，和正常外耳道皮肤相比，中耳胆脂瘤上皮中cdk2和cdk4的表达明显增加,而且在有严重炎症的上皮下，这种趋势更加明显，推测该处的炎症刺激可导致炎症细胞加速表达IL-I.KGF,而这些细胞分裂素又提高上皮细胞对
15、cdk2和cdk4的表达，细胞易通过Gl-S的限制，导致细胞增殖加速。二、骨质破坏的免疫学机制目前认为，中耳乳突胆脂瘤引起骨质破坏除了主要与局部压迫、破骨细胞浸润密切相关外，炎性细胞因子和多种酶引起的免疫学反应在骨质破坏机制中亦发挥重要的作用。胆脂瘤上皮的堆积一方面对周围骨质产生压迫，同时胆脂瘤基质及基质下方的炎性肉芽组织还可产生多种酶如溶酶体酶、胶原酶等，以及前列腺素和细胞因子等，可引起周围骨质脱钙和骨壁破坏，同时，胆脂瘤也在不断地向周围扩大。胆脂瘤基质是胆脂瘤外周部分，由肉芽组织、炎症侵犯的上皮下结缔组织组成，含有淋巴细胞、组织细胞、血浆细胞和少数的中性粒细胞，有时在胆脂瘤基质和邻近的骨质
16、之间可以见到破骨细胞。有学者通过电镜观察胆脂瘤周围的破坏骨片，发现在破坏的听小骨骨小梁的表面有活性破骨细胞存在，并见大量波纹状蓝染的骨质黏合线，提示破骨细胞参与了骨质破坏。上述骨质破坏的免疫学机制并非相互独立，而是彼此联系、相互影响。如细胞因子不但能激活破骨细胞活性，还能激活炎性细胞和上皮细胞释放一系列生物酶，引起骨组织脱钙，骨基质、骨蛋白的溶解，最终导致骨吸收。（一）组织酶学已经证实胆脂瘤组织中含有诸多酶类，例如碳酸酎酶、胶原酶、溶酶体酶类、非溶酶体酶类、基质金属蛋白酶（MMPS）和纤溶酶等多种酶类。这些酶类在中耳乳突胆脂瘤组织过度增殖、凋亡和骨质破坏的机制中可能发挥着重要作用。按照它们在发
17、病机制中的作用，这些酶分为参与脱矿物质的酶和参与基质降解的酶两类。参与脱矿物质的酶有碳酸酎酶和透明质酸酶等，它们在中耳乳突胆脂瘤致骨质吸收破坏的脱矿物质阶段发挥作用，碳酸酎酶参与氢离子的形成，大量氢离子的产生改变了胆脂瘤组织的pH,不仅直接参与骨质矿物质的溶解过程，而且为溶酶体酶破坏胶原作用提供了合适的酸性环境。参与基质降解的酶比较多，其中胶原酶是有机基质降解的主要因素，它主要是由成纤维细胞产生，巨噬细胞和成骨细胞也能产生胶原酶。胶原酶的产生可受多种细胞因子和其他一些因素的影响。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类能有效降解细胞外基质的锌离子依赖型蛋白质家族，在正常的生命过程中，它们参与结缔组织包
18、括骨组织的重建。其基因表达和活性的异常在牙周病、肿瘤浸润及转移、骨代谢和器官硬化性疾病的发生发展中起重要作用。20世纪90年代即有对人类胆脂瘤组织中MMPs家族表达的研究，发现MMP-2、MMP-9、MMP-3在胆脂瘤上皮的基底和基底上细胞层有表达，MMP-8在上皮和肉芽组织中也有稀疏分布。21世纪初的研究显示MMPT在胆脂瘤上皮的角质层到基底层均有较高的表达，且明显高于外耳道上皮。之后在胆脂瘤周围骨组织结构变化的研究中发现，胆脂瘤上皮附近的乳突骨组织的骨膜连续性中断、骨小梁紊乱，以及骨组织内存在MMP-2、MMP-9的表达，并与胆脂瘤组织中MMP-2、MMP-9表达密切相关。由此可见，MMP
19、S家族平衡紊乱导致的蛋白水解在中耳乳突胆脂瘤致骨吸收及细胞增殖的发病机制中起重要作用。MMPs的活性可受到许多因素的调控，如酶基因表达水平、酶原激活水平以及酶活性抑制和炎性介质等。进一步研究其调控机制，有助于了解胆脂瘤发病的免疫学机制，并进而为胆脂瘤的防治寻找新的途径。目前，一些MMPS抑制剂类药物已经处于临床药物试验阶段。另外，MMPs/TIMPs作为预测胆脂瘤骨浸润能力的指标及其在DNAmRNA、表达蛋白等各水平检测的意义、敏感性、应用价值，以及TlMPS作为基因治疗武器等，能否在胆脂瘤组织中发挥作用，均具有巨大的研究前景。除上述酶类之外，目前已有一些研究表明胆脂瘤组织中溶酶体水解酶、组织
20、蛋白酶B、酸性磷酸酶、亮氨酰氨基肽酶和溶菌酶等的水平均较正常皮肤明显增高。酸性磷酸酶是破骨细胞的一种特异性酶。组织蛋白酶B在酸性介质中降解胶原，通过胞饮作用被摄入细胞内，在胆脂瘤病理条件下,胶原迅速降解。亮氨酰氨基肽酶在胆脂瘤周围的结缔组织中有很强的水解活性。而溶菌酶作为吞噬酶的一种，是与某些细菌细胞壁黏多糖成分聚合作用相关的溶酶体酶，主要存在于单核细胞和粒细胞的特殊颗粒中。（二）细胞因子目前已经报道证实与中耳乳突胆脂瘤相关的细胞因子主要有IL-KIL-2、IL-6、IL-8、IL-9、TNFf和TGF-B等。其中IL-1、IL-6和TNF-a目前已有较深的了解。1. IL-I主要存在于正常及
21、变性的上皮细胞内，作为上皮细胞的自分泌生长因子刺激上皮细胞增生，促使骨质降解,是已知的引起骨质降解最有效的诱导因素之一。它有两种分子类型，ILTq能诱导未分化的成骨细胞，ILTB具有破骨细胞激活因子的活性，主要协同破骨细胞对骨质的吸收及胶原的降解。ILT定位于胆脂瘤上皮及基质，同时胆脂瘤邻近的单核细胞、骨细胞、角化的上皮细胞亦表达明显，虽然正常的外耳道皮肤亦有表达，但胆脂瘤上皮的表达明显高于正常皮肤。另外，胆脂瘤上皮细胞还能产生和分泌ILT,在胆脂瘤组织内形成自分泌环路，作用于未成熟的上皮细胞，使其增生、角化。Massuda和Oliveira研究表明，中耳乳突胆脂瘤基底细胞层均出现ILTnIR
22、NA的强表达，而胆脂瘤组织提取物中IL-2和IL-6也均高于正常外耳道皮肤，呈强表达。2. 肿瘤坏死因子(TNF-a)是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子。炎症刺激上皮细胞分泌TNF-a,进而刺激肉芽组织形成，随之局部浸润增多的多种炎性细胞(如巨噬细胞、单核细胞等)，也进一步致TNF-a水平再提高，如此正反馈形成恶性循环。20世纪90年代初首次证实TNF-存在于中耳乳突胆脂瘤上皮中，主要分布在胆脂瘤上皮基底层及基底层以上的各层细胞中。之后的研究显示TNF-a定位于胆脂瘤上皮及上皮下肉芽组织，中耳的上皮细胞因炎症活化也具有产生TNF-a的能力。且结合临床的研究表明，TNF-a在广泛的胆脂瘤中含
23、量比局限的胆脂瘤显著增高。事实上，中耳乳突胆脂瘤组织中的TNFf和酸性磷酸酶、溶酶体酶等的含量均明显高于正常外耳道皮肤。3. IL-6是一种重要的免疫细胞因子和炎性细胞因子，同ILT和TNF-a密切相关，可刺激骨髓粒细胞、巨噬细胞集落形成，继续刺激它们进一步形成破骨细胞的前体细胞，通过刺激破骨细胞的前体细胞的形成和分化，激发破骨细胞的活性，促进骨质吸收，导致骨质破坏。在中耳乳突胆脂瘤，IL-6主要位于胆脂瘤的上皮和上皮下基质，其在胆脂瘤上皮、基质及外耳道皮肤的阳性率分别为100%、100%和25%,表明IL-6在中耳乳突胆脂瘤中的表达明显高于外耳道皮肤。而且发现,IL-6在中耳乳突胆脂瘤的表达
24、与听骨链的破坏关系极为显著。IL-1.IL-6等和TNF-a相互影响、相互作用，共同介导中耳乳突胆脂瘤的骨质破坏。然而，由于细胞因子网络免疫调节的复杂性，很难确切说明具体每一种细胞因子在胆脂瘤发病机制中的作用，因此需要更为深入的研究。三、细胞凋亡和信号转导的调控高度增殖的胆脂瘤上皮中，已有越来越多的证据表明其基质中同时存在细胞凋亡现象。如Ergun等利用TUNEL技术和免疫组化技术检测了凋亡细胞在正常外耳道皮肤、中耳乳突胆脂瘤和中耳鳞状细胞癌中的表达，发现凋亡细胞主要存在于中耳乳突胆脂瘤和中耳鳞状细胞癌中，且中耳乳突胆脂瘤上皮细胞的凋亡现象比中耳鳞状细胞癌更为显著。胆脂瘤细胞的凋亡指数最高，中
25、耳鳞状细胞癌居次，正常外耳道皮肤最低。现在已经证明多种凋亡相关基因以及信号转导径路和调控因子参与了胆脂瘤细胞的凋亡机制。(一)凋亡相关基因细胞凋亡受基因控制，但癌基因是否参与中耳乳突胆脂瘤的形成尚无定论。目前已经检测到可能与中耳乳突胆脂瘤有关的癌基因主要有C-myc、C-jun.RAS蛋白等，有关的抑癌基因有P53、PI5、PI6、p27,凋亡抑制蛋白有Survlvln和bcl-2等。1 .癌基因(1) C-myc：在细胞增殖和凋亡调控中是一个重要的相关基因，具有诱导增殖和凋亡双重作用的基因。它的产物为转录因子，是细胞生长的正性调控物，促进细胞周期进展,尤其驱动细胞从Gl期进入S期。研究表明C
26、-myc在胆脂瘤上皮的基底层和其他层细胞的胞核均有表达，且表达强度高于正常外耳道上皮，说明C-myc在中耳乳突胆脂瘤上皮细胞增殖和凋亡调控中有重要作用。(2) C-jun基因：为编码转录活化因子，参与基因表达的调控。胆脂瘤上皮细胞的基底细胞层和棘细胞层有jun的表达，而正常上皮只有基底细胞层有表达，提示C-jun参与胆脂瘤上皮的增殖与分化。(3) RAS蛋白：由原癌基因RAS基因编码，是细胞生长分化信号传递通路上的分子开关蛋白，采用免疫组化方法发现胆脂瘤上皮各层角质细胞均有RAS蛋白的表达，正常外耳道皮肤则无表达，提示RAS基因参与胆脂瘤上皮的增殖与分化。2 .抑癌基因(I)p53:是一种抑制
27、细胞生长和促进细胞凋亡的基因，在细胞凋亡、细胞周期控制分化、角化细胞增殖和新生物形成过程中起基础作用。有研究证实p53在胆脂瘤上皮中有高表达，然而也有研究结果显示在胆脂瘤和外耳道皮肤中p53的表达极微量甚至无表达。还有研究表明，在中耳乳突胆脂瘤组织中C-jun和p53均高表达，并认为p53抑制转录因子如C-jun,C-fos基因的细胞增殖功能可发挥细胞增殖负调节功能从而介导凋亡。Huisman等的研究很有意思，该研究显示在胆脂瘤上皮中，细胞增殖的标志物Ki-67有表达，同时p53的表达亦增强，但两者之间无相关性。提示在胆脂瘤上皮形成中，既有Ki-67标志的细胞增殖，又有p53诱导上皮细胞增殖停
28、滞在Gl期或程序细胞死亡导致的细胞凋亡。(2) p27：是一种新的抑癌蛋白，是一种广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的抑制因子(CDKI)。有研究采用免疫组化方法证明p27在胆脂瘤上皮中高表达，且主要表达在上皮细胞的胞核，在棘层、颗粒层及基底旁层中有散在表达。研究还证实胆脂瘤上皮细胞的凋亡明显高于耳后皮肤，而且都在基底层以上，基底层中没有发现，这和p27在胆脂瘤上皮中的表达部位相一致。因此认为p27在胆脂瘤上皮中的高表达，诱导上皮细胞凋亡，促使细胞碎屑堆积，导致胆脂瘤形成。但相反的研究结果是发现p27在胆脂瘤上皮中的表达明显低于外耳道皮肤，该研究认为p27在胆脂瘤上皮中的表达降低，使胆脂瘤
29、上皮细胞顺利地从G1期进入S期，导致的是上皮细胞过度增生，而非细胞凋亡。因此目前对p27在胆脂瘤的发病机制中的具体作用尚无定论。3 .凋亡抑制蛋白(I)SUrViVin蛋白：是凋亡抑制蛋白家族(IAP)的一个新成员，具有抗细胞凋亡作用，是迄今发现最强的凋亡抑制蛋白，它是经效应细胞蛋白酶受体cDNA在人类基因组库的杂交筛选中分离出来的。Survlvin位于染色体的17q25,长度范围为75130kb,由L9kb的mRNA转录和编码，是含142个氨基酸的蛋白。SUrVIVin蛋白属于一类防止细胞自我破坏(即凋亡)的蛋白质，主要通过抑制凋亡酶的作用来阻碍其把细胞送上自杀的道路。(2) bcl-2和b
30、ax基因：也是受到高度关注的细胞凋亡调控基因。bcl-2抑制细胞凋亡，bax促进细胞凋亡。bcl-2/bax两蛋白的比值是决定细胞接受刺激信号后凋亡抑制作用强弱的关键因素。不同患者的胆脂瘤标本中Survlvin及bcl-2的表达范围基本一致，即在基底层的表达范围较基底上层为广，从基底层至基底上层表达都呈现减低趋势，而且两者在胆脂瘤标本的表达水平都明显高于皮肤对照，同一胆脂瘤标本中，Survlvin表达指数与bcl-2表达指数之间有显著的相关性。凋亡抑制蛋白Survlvin和bcl-2在中耳乳突胆脂瘤的异常表达,说明在胆脂瘤上皮增殖的同时，伴有SUrVIVin和bcl-2的产生，且细胞增生程度加
31、重，提示Survlvin和bcl-2可能参与了胆脂瘤上皮的凋亡调控过程。减少Survlvin和bcl-2的产生可能会有效减少中耳乳突胆脂瘤的增殖。(二)细胞信号转导径路和调控因子1.caspasecaspase家族属于半胱氨酸基天冬氨酸基一特异性蛋白水解酶，目前认为CaSPaSe是一切凋亡信号转导的共同通路，各种CaSPaSe被层层激活，最终引发细胞凋亡。(1) caspase-3：是FaS介导细胞凋亡蛋白酶级联反应中的核心蛋白酶，抑制CaSPaSe-3酶活性或拮抗CaSPaSe-3功能可抑制Fas介导的细胞凋亡，说明CaSPaSe-3对Fas介导的细胞凋亡是必需的。近年国内有研究表明CaSP
32、aSe-3在胆脂瘤中的表达显著高于正常上皮，并与凋亡呈正相关，该研究还发现胆脂瘤上皮中XIAP表达与caspase-3表达及凋亡均呈负相关。(2) caspase-8：在胆脂瘤上皮各层细胞中也均有强表达.而正常外耳道皮肤表达较弱，提示其可能参与了中耳胆脂瘤上皮细胞的过度凋亡及增殖的调控。2 .Fas又称APO-I或CD95,是分子质量为44000的凋亡受体，属于神经生长因子(NGF)/肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，广泛存在于多种组织细胞。Fas通过两种方式与JNK/SAPK通路相互作用，启动细胞凋亡发生。一是通过一个新的结合器Daxx与Fas的死亡结构域DD结合，并通过一个应激JNK的
33、上游激酶SEK-I活化JNK；二是通过caspase-8分裂出来的P21活化激酶-2(PAK-2)来活化JNK/SAPK通路。Fas启动的细胞凋亡与线粒体通透性改变有关，Fas介导的细胞凋亡通常是由Fas受体和Fas配体来调节的。对10例中耳手术中取得的胆脂瘤和耳后皮肤进行研究,采用TUNEL染色技术和基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡，用免疫组化方法检测FasAP0T蛋白的表达，结果发现TUNEL染色在9例胆脂瘤上皮的基底层以上有较多的阳性细胞核，而在耳后皮肤仅有少数阳性细胞出现在颗粒层，免疫印迹分析和免疫组化发现Fas/APO-1蛋白在8例胆脂瘤上皮表达阳性。Fas/APO-1蛋白表达
34、部位与TUNEL阳性细胞分布基本一致。3 .蛋白激酶C(PKC)是一族组织相近、磷脂依赖、甘油二酯活化的同工酶，在多种细胞传导通路中发挥关键作用。PKC广泛参与细胞信号转导、癌基因活化、蛋白质磷酸化和细胞对生长因子应答等多种生理、生化及病理过程。PKC作为基因转录调节剂，调节许多转录因子的活性。PKC持续活化或超表达可导致细胞增殖和形态学方面的改变。蛋白激酶C-(PKC)和蛋白激酶c-n(PKCn)被认为在分化信号转导过程中起关键作用；细胞角蛋白1(CKI)和细胞角蛋白10(CKlO)是构成细胞支架的基本蛋白。1999年Miyazaki等用免疫组化染色技术，比较胆脂瘤上皮和正常外耳道皮肤中的P
35、KC8、PKCT、CK1、CKlO和involucrin的表达情况，发现胆脂瘤上皮和正常外耳道皮肤的PKCPKCTl表达模式未见明显差异，主要表达于棘层和粒层，CKhCKlo和in-volucrin的表达模式也几乎与此完全相同。由此结论，胆脂瘤表皮角抗细胞的最终分化与正常外耳道皮肤组织相同，机制是几种细胞因子水平升高致角腕细胞过度分化导致胆脂瘤上皮的生长，受控于最终分化和凋亡。4 .其他调控因子Ton样受体2(TLR-2)是一种跨膜受体，在病原体感染机体中可发挥天然免疫作用，并通过其胞内信号转导而连接获得性免疫。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是一种可降解细胞外基质的内肽酶，其作用底物为I、II
36、I、IV、V型胶原以及明胶等。近年来研究发现，相对于正常外耳道上皮，中耳的胆脂瘤上皮中TLR-2和MMP-9均为高表达。其他如NF-KBp65蛋白在中耳胆脂瘤上皮组织中阳性表达率为63.3%,明显高于正常外耳道皮肤组的200%(5) DNA和染色体异常新近有研究报道胆脂瘤细胞中的humanmicroRNA-21(hsa-mlR-21)比正常外耳道上皮细胞长4.4folder,且hsa-miR-21的下游目标PTEN和程序性死亡因子4在大部分胆脂瘤组织中显著减少。其实之前的体外培养研究已经发现,增殖活动活跃的胆脂瘤存在染色体的不稳定性，特别是7号染色体三倍体的出现，研究采用PClO单克隆抗体免疫
37、组化检查增殖期细胞核抗原(PCNA)以及以特异性-a卫星DNA为探针进行染色体荧光原位杂交观察7号染色体，结果证实7号染色体三倍体与高PCNA指数有显著相关性。(四)其他关于细胞凋亡的研究L端粒和端粒酶端粒是真核细胞线性染色体末端富含G的简单重复结构。正常情况下，细胞每分裂一次，将损失端粒DNA30150bp,使端粒逐渐缩短。当端粒缩短至一定长度时，细胞即生长停滞、衰老，直至死亡。端粒酶是一种特殊的逆转录酶，能合成端粒DNA添加到染色体末端，防止DNA复制造成端粒缩短，以维持染色体长度稳定性。端粒酶与细胞衰老、永生及肿瘤的发生密切关系。近年有研究用TUNEL技术检测胆脂瘤和鳞癌组织的端粒酶活性
38、及端粒的长度，发现鳞癌组织中，端粒酶的活性为66%,而在胆脂瘤组织中仅为3.4%,但是尽管端粒酶活性在两者之间有很大差异，端粒的长度相似。实验发现胆脂瘤上皮的细胞凋亡率为30%,而鳞癌组织细胞凋亡率仅为3%,两者存在显著性差异。胆脂瘤上皮中低端粒酶活性与高细胞凋亡相对应，说明端粒酶的激活在胆脂瘤形成中不起重要作用，相反，端粒酶活性的缺失可诱导细胞凋亡，限制胆脂瘤上皮的增殖能力。2 .半乳糖凝集素即B-半乳糖昔结合蛋白，有16种亚型，在细胞凋亡和对各个组织内的细胞黏附水平起显著的调节作用。应用免疫组化法对70例胆脂瘤标本检测均发现galecti11-l表达显著。3 .热激蛋白(HSP)免疫组化研
39、究发现HSP60和HSP70出现在胆脂瘤各层角质细胞的胞质中，HSP70在角质细胞的胞核中也有表达。而在正常的外耳道皮肤中一般检测不到HSPsHSP70可以稳定p53蛋白从而延长p53的作用。用TUNEL方法检测胆脂瘤上皮(CE)、正常的外耳道皮肤(NAMS)和胆脂瘤患者的外耳道皮肤(CAMS)的细胞凋亡时发现，NAMS和CAMS中凋亡细胞位于上皮最外层，数量较少，而CE中，凋亡细胞分布在颗粒层、棘层，数量较多，进一步说明CE中棘层细胞已开始凋亡，且细胞凋亡增强。四、胆脂瘤与中耳及全身免疫反应胆脂瘤的免疫反应可以认为是针对隐匿在胆脂瘤囊中的细菌和其他病原体的蛋白质的。在对胆脂瘤组织的培养中,已
40、经证实同时有需氧菌和厌氧菌存在。机体首先启动天然免疫机制，通过补体系统和巨噬细胞等来清除这些微生物和抗原物质。但当不能完全清除病变时，则会进一步启动特异性免疫系统。此时细胞介导的免疫系统被激活，胆脂瘤的基质中有以T淋巴细胞为主的多个免疫细胞浸润，后者可分泌SIgA及多种生物因子如IT、IL-6、IL-8及TNF-a,从而引起结缔组织破坏和骨质吸收等破坏性病变。目前已报道与局部和全身免疫反应密切相关的因素有人B防御素和朗格汉斯细胞（LC）。（一）中耳乳突胆脂瘤与人B防御素人B防御素2（HDB-2）是细菌和前炎性因子刺激下合成表达的抗菌肽，主要分布在感染后的皮肤和黏膜组织中，构成机体抵御微生物的第
41、一道化学屏障，近年来的研究表明其在中耳乳突胆脂瘤的形成和发展的免疫学机制中起一定作用。已经有通过免疫组织化学技术和RT-PCR法检测证实了人类中耳胆脂瘤中HDB-2表达高于外耳道皮肤的报道，而HDB-I在胆脂瘤与外耳道皮肤中的表达基本相同，指出B防御素在中耳乳突胆脂瘤的慢性炎症状态中有重要作用。另一个用RT-PCR和Westernblot法检测胆脂瘤组织中HDB-2和HDB-3的RNAS和蛋白的研究得出了相似的结果，即胆脂瘤上皮的上颗粒层和棘细胞层均表达HDB-2和HDB-3,而正常的外耳道上皮各层均未见表达。HDB-2和HDB-3的增强表达提示胆脂瘤作为中耳角化细胞的慢性炎症状态，可引起机体
42、的免疫应答。胆脂瘤上皮和皮肤表皮具有相似的结构和功能，HDB-2在胆脂瘤上皮中的表达及作用值得重视。近年国内有研究采用免疫组织化学观察21例中耳乳突胆脂瘤上皮和10例外耳道正常皮肤表皮中HDB-2的表达及H朗格汉斯细胞(LC)的密度，结果表明胆脂瘤上皮中的HDB-2的表达水平及LC密度较外耳道皮肤表皮增高，且胆脂瘤上皮中HDB-2表达与上皮内LC的密度存在正相关。胆脂瘤上皮中HDB-2可能是LC重要的趋化因子，在连接特异与非特异性免疫中扮演一定角色。胆脂瘤上皮中HDB-2表达的明显上调，可能与胆脂瘤组织中细胞因子，隐匿在胆脂瘤中细菌、内毒素等的持续刺激有关。由于HDB-2具有天然的抗菌功能，在
43、与病菌感染关系密切的胆脂瘤病变中表达增高，对维持局部抗菌环境具有重要意义。(二)中耳乳突胆脂瘤中的LangerhanS细胞LangerhanS细胞(LC)为抗原提呈细胞(APC),是免疫活性细胞之一。LC胞质中有特殊的BirbeCk颗粒，呈棒状或网球拍状，功能尚不明确。LC外膜有突起，细胞表面有多种免疫标志，对LC的鉴定和免疫功能有一定的意义。LC表面有MHCn级分子表达，实验证明小鼠中只有Ia阳性细胞才有辅助T淋巴细胞的分化、增殖功能，如以Ia抗体处理则使此功能消失。LC上有CD4、CD8等抗原表达，它们在抗原提呈过程中也起到一些作用。Le表面有镁依赖性三磷酸腺甘酶(Mg-ATPase),细
44、胞内存在STOO角蛋白，功能尚未知晓。在中耳乳突胆脂瘤以及与其相邻的含有炎性细胞浸润的黏膜中可检出Mg-ATPase阳性并带有树突状突起的典型的LC体，而健康的鼓膜中几乎看不到LC,外耳道和耳后皮肤也与身体其他部位的皮肤一样可见LC。中耳乳突胆脂瘤上皮中LC数目较正常外耳道皮肤明显增多。CDl阳性细胞在有上皮组织的胆脂瘤标本中，可见CDl阳性树突状LC细胞，按两种方式分布，聚集成团的CDl阳性细胞充满整个上皮，从基底层直达顶层，各个细胞借它们的丝状树枝状突起彼此相连。在这些聚集的细胞之外,还可见到散在的CDl阳性DC,位于上皮的基底层以上，这些细胞的树突状突起明显较聚集的细胞团中者少。在炎症严
45、重的情况下，胆脂瘤的基质中也可见CDl阳性DC位于近上皮处，这些细胞多数集中在上皮组织的CDl阳性细胞团边缘。胆脂瘤中见不到脱落的CDl阳性细胞。T淋巴细胞在胆脂瘤的上皮中，CD5阳性细胞仅见于基底层连续切片显示它们主要集结于CDl阳性DC聚集成团的区域。孤立的CD8阳性细胞也主要见于上皮中CDI阳性细胞聚集成团的区域，其下的基质中可见沿鳞状上皮分布的CD8和CD4阳性淋巴细胞形成的混合集落，其中2种淋巴细胞的数量大致相等。在距离上皮稍远处，CD8较CD4阳性细胞数量为多。胆脂瘤中CD3和CD68表达明显高于外耳道皮肤。(三)中耳乳突胆脂瘤与嗜酸性胶体和黏膜免疫共享嗜酸性胶体是皮肤苔葬样组织反
46、应(LTR)的特征表现，LTR是移植物抗宿主反应和红斑狼疮常见的组织学表现。嗜酸性胶体的出现是由上皮细胞的细胞毒性免疫应答产生的,说明上皮基底细胞的损害。有研究已经证实在部分胆脂瘤标本的上皮中存在嗜酸性胶体，且电镜下胆脂瘤基底层角化细胞、细胞器退行性变和胞桥小体消失等超微结构改变也见于LTR,由此表明细胞介导的免疫应答也参与了胆脂瘤的发病机制。中耳黏膜是全身黏膜防御系统的一部分，它不仅具有强大的天然免疫系统，还可通过特异抗原刺激诱导产生细胞免疫和体液免疫。一个部位黏膜如鼻腔黏膜被抗原刺激激活鼻相关淋巴滤泡的淋巴细胞，激活的淋巴细胞可通过淋巴循环或血液循环进入其他部位的黏膜产生免疫反应，这就是所谓的黏膜免疫共享(CMIS)的概念。在动物实验中，用不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)分离的外膜蛋白(OMP)接种鼻黏膜后，鼻咽黏膜OMP特定IgA及其形成细胞明显增多，NTHi清除率也提高。近年，用NTHi外膜蛋白中的P6蛋白结合霍乱毒素鼻内接种，在动物实验中证明是一种比较有效的预防中耳炎的免疫接种手段。HBD2和BPl是存在于人体的天然抗菌蛋白（肽），其对中耳炎的潜在治疗作用正在引起人们的兴趣。
