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1、摘要人体内的肠道微生物群在维持生理稳态中一直发挥着重要作用，为人类健康提供内部支持。其中目前对肠道微生物的检测手段除了有传统培养法、下一代测序技术(NGS)两种以外。目前.，这些研究方法中普遍存在着一些明显的缺陷，如操作步骤繁多、耗费时间长、准确率低下、研究成本高等问题。除了以上两种，还有荧光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR两种方法。本文旨在开发出一种利用实时荧光定量PCR来定向检测阿克曼氏菌的方法，通过该方法可以快速高效地在低成本的条件下定向检测阿克曼氏菌的数量并加以分析，由此为阿克曼氏菌的深入研究提供更加高效的大量数据支持。为了设计出特异性强，灵敏度高的引物探针组合，先从NCBI数
2、据库中检索阿克曼氏菌的全基因组数据。找到16SrRNA序列保守区，通过MEGA软件先将序列进行对齐，根据阿克曼氏菌的特征SNP位点设计特异性强的引物探针组合，然后送到上海生工进行合成。本实验所检测的是人肠道微生物阿克曼氏菌，样本均为人粪便样本，能更好的反映人的肠道微生物组成。通过粪便微生物DNA提取试剂盒QIAamPPowerFecalProDNAKit进行微生物基因组DNA提取，使用过验证合格的引物先进行普通PCR扩增检测，琼脂糖凝胶电泳验证后再用qPCR检测手段去验证是否符合实验要求。在HITdb数据库中选择目标菌种后，我们设计了具有特异性的引物和探针，并验证了靶向菌种的覆盖率超过70%o
3、通过比较文献数据和实验验证，筛选出适用于TaqManqPCR的肠道微生物标记基因，建立标准曲线，实现对肠道微生物数量的快速定量。通过对不同样本的检测和比较，我们获得了检测结果的变异系数小于10%的证明，说明该方法具有很高的稳定性。我们将T叫ManqPCR方法检测结果与16srRNA测序结果进行了相关性分析，结果较为显著(p0.05),验证了该方法的有效性。本研究根据Hrrdb数据库设计的靶向微生物群的引物和探针检测到的粪便样本中微生物的相对丰度结果与16SrRNA测序结果相吻合。该研究可以为各种微生物行业提供更高的效益，同时也为临床诊断制定治疗方案提供了快速有效的参考信息。关键词：肠道微生物群
4、；阿克曼氏菌；琼脂糖凝胶电泳；实时荧光定量PCRAbstractTheintestinalmicrobiotainthehumanbodyplaysanimportantroleinmaintainingphysiologicalhomeostasisandprovidinginternalsupportforhumanhealth.Currently,therearetwocommonlyusedmethodsfordetectingintestinalmicrobiota:traditionalcultivationandnext-generationsequencing(NGS).How
5、ever,thesemethodshavesomeobviousdefects,suchascomplexoperationsteps,longtimeconsumption,lowaccuracy,andhighresearchcosts.Inadditiontothesetwomethods,therearetwoothermethods:fluorescenceinsituhybridization(FISH)andreal-timefluorescencequantitativePCR.Thisarticleaimstodevelopamethodfortargeteddetectio
6、nofAkkermansiamuciniphilausingreal-timefluorescencequantitativePCR,whichcanquicklyandefficientlydetectandanalyzethenumberofAkkermansiamuciniphilaunderlow-costconditions.Thisprovidesmoreefficientandmassivedatasupportforthein-depthstudyofAkkermansiamuciniphila.Inordertodesignaprimerprobecombinationwit
7、hhighspecificityandsensitivity,thewhole-genomedataofAkkennansiamuciniphilawasretrievedfromtheNCBIdatabase.Theconservedregionofthe16SrRNAsequencewasfound,andthesequencewasalignedusingMEGAsoftware.BasedonthecharacteristicSNPsitesofAkkermansiamuciniphila,aprimerprobecombinationwithstrongspecificitywasd
8、esignedandsynthesizedbyShanghaiBioengineering.Thesamplestestedinthisexperimentwerehumanfecalsamples,whichbetterreflectthecompositionofhumanintestinalmicrobiota.MicrobialgenomicDNAwasextractedusingtheQIAampPowerFecalProDNAKit,andthevalidatedprimerswerefirstusedforordinaryPCRamplificationdetection.Aft
9、erverificationbyagarosegelelectrophoresis,qPCRwasusedtoverifywhetheritmettheexperimentalrequirements.AfterselectingthetargetbacterialspeciesintheHITdbdatabase,wedesignedspecificprimersandprobes,andverifiedthatthecoverageofthetargetedbacterialspeciesexceeded70%.Bycomparingliteraturedataandexperimenta
10、lverification,wescreenedforintestinalmicrobialmarkergenessuitableforTaqManqPCR,establishedastandardcurve,andachievedrapidquantificationofintestinalmicrobialquantity.Bydetectingandcomparingdifferentsamples,Weobtainedproofthatthecoefficientofvariationofthedetectionresultswaslessthan10%,indicatingthatt
11、hismethodhashighstability.WeconductedacorrelationanalysisbetweentheTaqManqPCRdetectionresultsandthe16SrRNAsequencingresults,andtheresultsweresignificant(p2mL无菌离心管上海BBI生命科学15mL、50mL离心管NESTBiotech2.2 实验方法2.2.1 样本的预处理a.使用电子天平称取（Hg粪便，放入2mL无菌离心管中，然后将其放在冰上。b.向每个粪便样品中加入ImLlnhibitEX缓冲液，连续涡旋直到粪便样品完全均质。C.将样品离
12、心14,000转/分钟处理1分钟，使粪便颗粒沉淀。如果上清液中仍然可见颗粒，则再次离心样品。d.加入25L蛋白酶K到新的2mL无菌离心管中。e.加入600L上清液到含有蛋白酶K的2mL无菌离心管中。f.加入60（）L缓冲液AL并涡旋15秒。必须将样品和缓冲液AL充分混合，形成均匀的溶液。g.放入金属浴70孵育10分钟。短暂离心以去除管盖内部的液滴。h.向裂解物中加入600L乙醇（96-100%）,并通过涡旋混合。短暂离心以去除管盖内部的液滴。2.2.2 DNA浓度检测取1.5LDNA溶液加入到Denovix超微量核酸检测仪，定量提取方法DNA浓度和A260A280o使用Denovix荧光核酸检
13、测仪对DNA浓度精准定量。2.2.3 琼脂糖凝胶电泳1 .在电泳槽中加入1TAE电泳缓冲液后，准确称取一定量的琼脂糖干粉，加入到合适体积的锥形瓶中。2 .加入一定量的电泳缓冲液（约30ml的1TAE）,放入微波炉中加热融化，冷却片刻（不烫手即可）后加入1L的染料。3 .摇晃混合融化后的琼脂溶液并倒入电泳槽中，等待其凝固。4 .等待3040分钟左右室温下凝固，小心地拔出梳子，取出凝固好的凝胶放入电泳槽内，并在胶面上方约Imm处倒入足够的电泳缓冲液，去除胶孔内的气泡，准备上样。5 .将5L的DNA样品加入1L的上样缓冲液(Ioadingbuffer)中，混匀后加入凝胶孔中。6 .上样完成后，接通电
14、源，红色正极，黑色负极，DNA样品会被带往正极，加样孔侧为负极。7 .设置电压为IOoV,恒流为400mA,40分钟后关闭电源。在凝胶成像仪上观察样本位置并比对marker判断大小。2.3TaqManqPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌实验2.3.1 靶标筛选通过人类肠道宏基因组公共数据库(GMrePO：https:/gmrepo.humangut.info./home)获得大量阿克曼氏菌样本的数据，并在出现频率和相对丰度的条件下对样本数据进行筛选，得出所需的流行物种列表，选择目标靶标分类群。2.3.2 TaqManqPCR检测方法的建立为了识别针对特定肠道微生物群的引物和探针，需要分析基因序列
15、以识别在给定群体中高度保守的区域以及足以将该群体与肠道微生物组的其他成员区分开来的区域。首先使用NCBI设计引物和探针。在选择每个靶标的特定保守区序列后，通过Ncbi-BLAST算法获得所选基因序列的物种特异性，并设计参数比如引物长度、探针长度、扩增子长度、熔解温度、GC含量等，以获得更高的成功率。为了提高TaqMan探针的稳定性、特异性和灵敏度，每个探针至少应包含4个锁定的特异性碱基。接着使用PCR与qPCR扩增验证引物和探针的稳定性与特异性。通过BLAST搜索将扩增的序列与相应的微生物基因组进行比较，验证引物和探针的靶向微生物的覆盖度。使用PCR扩增验证引物的特异性，反应体系为50L(最终
16、体积)的PCR混合物，由上游下游各lL弓|物(终浓度0.4M)、25LMix(2xTaqPCRMix,Vazyme)和lpg50ngDNA模板组成。得到PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳验证目的条带，再通过qPCR检测多重反应中所有引物的稳定性。2.3.3 样本DNA提取1 .将PowerBeadPro管简短离心，以确保珠子沉淀在底部，添加大约250mg的粪便和800L的CDl溶液。简短涡旋混合。2 .将PowerBeadPro管水平固定在VortexAdapter上，用于1.5-2mL管，以最大速度涡旋10分钟。(注意：如果同时使用VorteXAdaPter进行12个以上的准备，请将涡旋时间增加
17、5-10分钟。)3 .将PowerBeadPro管以15,000Xg转速离心1分钟。4 .将上清液转移到干净的2mL微离心管中，在添加200L的CD2溶液后进行涡旋处理5秒钟。（注意：预计500600L0上清液可能仍然含有一些粪便颗粒。）5 .以15,000Xg转速离心1分钟。为避免颗粒过多，将最多700L的上清液转移到干净的2mL微离心管中。（注意：预计使用为500-6（X）L0）6 .在管中添加600L的CD3溶液，并涡旋5秒钟。7 .将650L的裂解物加载到MBSpin柱上，并以15,000Xg转速离心处理1分钟。8 .再次将所得物加载到MBSPin柱张，以确保所有赤潮已通过MB旋转柱。
18、9 .小心地将处理后的MB旋转柱放入干净的2mL收集管，操作中要避免将任何流体溅到MB旋转柱上。10 .向MB旋转柱中加入EA溶液500l后，以15,0（X）Xg转速离心操作1分钟。IL丢弃流体,并将MB旋转柱放回同一2mL收集管中，向MB旋转柱中加入500lC5溶液并以15,00OXg转速离心操作1分钟。12 .丢弃流体，并将MB旋转柱放入新的2mL收集管（附带），以高达16,000xg转速离心操作2分钟。小心地将MB旋转柱放入新的1.5毫升洗脱管（附带）。13 .向白色过滤膜中心加入50-100lC6溶液，以15,00OXg转速条件离心操作1分钟。14.丢弃MB旋转柱。将所得DNA进行保藏
19、处理。（注意：由于C6溶液不含EDTA,建议将DNA冷冻保存。）QIAampPowerFecalProDNAKit可以从粪便和肠道样本中分离微生物和宿主基因组DNA,为粪便DNA的提取提供一种专有的方法，即使是最困难的粪便类型，也能有效去除PCR抑制剂。实验时，每份粪便样本称取0.2g用于提取DNA。提取后测量DNA浓度，并储存在20C以便进一步分析。2.3.4阿克曼氏菌的TaqManqPCR检测使用CFXConneCtTM荧光定量PCR检测系统（BioRad）并在0.1mLPCR八连管（NEST）中进行反应。引物和TaqMan探针的序列见表2.3。每个样品设置两组平行实验，反应总体系为20L（AnimalDetectionU+ProbeMasterMix,0.4M引物，0.2MTaqMan探针和1L模板DNA）。所有qPCR反应均通过以下热循环程序进行：37,2分钟（此步使用UDG酶,建立PCR防污染体系，保证PCR扩增结果的准确性）；9530s；9510s,60r30s,40次循环。通过qPCR获得的基因扩增水平显示为与初始DNA浓度成反比的CT值。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，通过获得的样品Ct值，从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。CF
