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1、探究抗生素对细菌的选择作用实验改进摘要为探索抗生素对细菌的选择作用的适宜抗生素浓度，增加了预实验，比较不同浓度的抗生素抑菌效果。改进原实验滤纸圆片法为打孔法获得的抑菌圈清晰均匀，误差小，实验操作简便；涂布平板法改进为预加菌液法获得的菌体生长均匀，效果明显，实验重复性高且效果好。关键词抗生素；抑菌圈；滤纸圆片法；打孔法；连续培养引言探究抗生素对细菌的选择作用是新教材人教版（2019版）必修二第六章第3节第一部分种群基因组成的变化中探究实验，在原教材中，本实验是作为课后练习题,新课标对本实验的要求是探讨细菌耐药性的出现与抗生素滥用的关系，解释现存生物适应性的原因。以此来提高科学探究能力，培养科学思
2、维，落实生物学核心素养。新教材中设置目的是通过探究实验方案的设计，并分析结果，学会运用进化与适应观，解释生物进化的普遍性，深切认识到滥用抗生素类药物的危害。其原理是一定浓度的抗生素会杀死细菌，但变异的细菌可能产生耐药性，如果连续培养，并在培养基中添加抗生素，耐药菌有可能存活下来。实验步骤方法是将含有抗生素的滤纸片放在接种过细菌的培养基上，经过一段时间恒温培养后，滤纸片周围就会出现抑菌圈，从抑菌圈的内侧边缘上挑取菌落，进行连续培养，以此重复几代，记录每一代培养物的抑菌圈直径，从而推导出细菌耐药性的变异及抗生素的选择作用。笔者开展此实验后，发现使用原方法获得的抑菌圈形状不均匀，很难测量，误差较大，
3、因此笔者从实验方法上进行了改进。一、材料用具大肠埃希氏菌ATCC25922（E.coli）、卡那氯霉素（Kan）、氨茉青霉素（Amp）LB琼脂培养基、LB液体培养基、无菌水、移液器及移液器枪头、滤纸圆片、培养皿、接种环、涂布棒、酒精灯、质量分数为70%的酒精、烧杯、记号笔、直尺、锻子、EP管、打孔器、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、干热灭菌箱、震荡培养箱。二、实验操作与过程1制备菌液和抗生素将购买的甘油菌种划线到平板培养基上，恒温（37）培养18-24h,挑取单菌落接种至100ml液体培养基中恒温摇床震荡培养16h,菌液冰箱保存备用。Kan和AmP用无菌水配好（Kan40mgml,Ampl00mg
4、ml）贮存备用。2实验流程（1）实验所用到的相关仪器和培养基进行高压蒸汽灭菌；（2）倒平板并涂布平板法接种E.c。”；（3）做标记并将含有抗生素的滤纸片放在培养基上；（4）恒温培养，37恒温培养箱连续培养18h；（5）连续培养，记录每一代的抑菌圈直径；（6）整理数据，分析结果。3实验方法改进（1）增加预实验由于教材中并没有给出具体的抗生素和浓度，因此在开展实验前增加了尝试探究两种抗生素的使用浓度对E.coli的抑菌效果，分别对Kan和Amp进行了梯度浓度实验，比较不同浓度下的抑菌圈大小，继而选择后续开展实验所使用的适宜浓度。（2）选用打孔法代替滤纸圆片法教材中采用的是滤纸圆片法，但实际操作过程
5、中易使滤纸片圆片上抗生素吸附的含量不同，从而造成抑菌圈大小不一，误差较大，且操作上较繁琐。笔者通过查阅资料将滤纸圆片法改为打孔法，即用灭过菌的打孔器在涂布过菌液的培养基上打一个小孔，用灭过菌的镣子挑取孔内的培养基，用移液器注入50l的抗生素，冰箱预扩散Ih后，再37恒温培养。（3）预加菌液法代替涂布平板接种法由于微生物培养要到选修课程才开展，学生对于微生物培养没有基础，因此在进行涂布平板法接种过程中，容易造成菌液涂布不均匀，引起菌体生长不够均匀，影响抑菌圈直径的测量。笔者通过查阅相关资料，采用预加菌液法代替涂布平板法,即直接把菌液加入到冷却至40-5（C的培养基中，摇匀后再倒平板，冷却凝固后采
6、用打孔法加入抗生素。三、实验结果与分析1不同方法获得的抑菌圈比较图1不同抑菌圈方法的比从图1中可以看出，滤纸圆片法获得的抑菌圈大小不均匀，且平行重复实验在同一个平板上，容易造成抑菌圈交叉现象，影响测量，这是由于在蘸取抗生素过程中滤纸片上吸附的量很难控制，且重复性较差，不适宜定量实验，只适合定性实验。采用改进后的方法获得的抑菌圈均匀规则便于测量，且重复性高，方法上操作简便,同时为避免抑菌圈交叉采用多个平板进行平行重复实验。2不同实验平板制备的比较可以看出，采用预加菌液法获得的平板质量最高，菌体均匀生长；测量抑菌圈直径，打孔法误差最小，并且实验经过多次重复，误差小。分析实验过程中的操作细节，涂布滤
7、纸片法和涂布打孔法获得的菌体生长不够均匀的原因可能是操作不熟练造成菌液涂布不均匀，从而不能很好的分布于平板各个角落，多次重复效果差；预加菌液法获得的平板质量最高，原因是在倒平板前将菌液加入培养基中摇匀后再倒，保证所有平板中菌液的浓度是一致的，从而使菌体均匀生长。因此后续实验可以采用预加菌液打孔法。3抗生素最适浓度实验图3抗生素最适浓度实验结果不同浓度的抗生素抑菌效果是不一样的，形成的抑菌圈大小也是有差别的。为了探究实验中Kan和Amp的使用浓度对E.coli的抑菌效果，分别对Kan和Amp进行了梯度浓度实验，其对抑菌圈大小的影响结果如图3所示。从图3可以看出，抑菌圈的大小与使用的抗生素浓度成正
8、相关，即随着Kan和Amp浓度的增大，抑菌圈直径也在增大，Kan板上的抑菌圈从16mm增加到243.mm,Amp板上的抑菌圈从8.5mm增加到21mmo其中，当Kan和Amp使用浓度分别在400gml和IooolIg/ml时，抑菌圈大小分别为22mm和18mm,是理想中的抑菌圈大小(18mm22mm)。因此，后续传代培养实验采用的Kan和Amp浓度分别为400gml和1000gmL4连续培养实验结果分析从图4可知，抑菌圈大小与连续培养的次数成负相关，即随着连续培养次数增加抑菌圈直径随之减小，Kan的抑菌圈从22.3mm减小到15mm,Amp的抑菌圈从18mm减小到到IOmmo说明抗生素对E.c
9、oli进行逐代选择，导致有利变异积累时E.coli的耐药性越来越强。比较Kan和Amp的抑菌效果发现，Kan较Amp抑菌效果强。根据实验结果联系生活可知，使用抗生素量要足，否则达不到药效，但也不能超量使用；合理选择效价强的抗生素，才可达到治疗目的；细菌的耐药性是抗生素不断选择的结果，应谨慎选择使用抗生素，避免超级细菌的产生。四、讨论本实验以Kan、AmP和c。为实验材料探究了抗生素对细菌的选择作用，结果表明随着传代次数增加，细菌的耐药性越来越强，从而深切认识到滥用抗生素类药物的危害。在探究实验过程中，对于实验方法的改进，比较不同方法获得的抑菌圈、不同实验平板的制备和增加预实验，结果表明：（1）
10、打孔法获得的抑菌圈最清晰，测量方便，减小误差，重复性高；（2）预加菌液法获得的平板质量最高，菌体均匀生长，减小操作误差；（3）增加预实验，避免盲目开展实验，使实验更加科学严谨，减少材料、时间的浪费。整体改进后，优化了教材原方案，增加可重复性。实验者在操作过程中也要注意以下几点：一是倒平板过程中应注意培养基的厚薄，否则会影响抑菌圈的质量；二是采用打孔法应小心操作，打孔后用锻子小心挑去培养基，保证小孔的完整性，否则易造成抑菌圈形状不规则；三是实验结束后所有实验使用过的移液器枪头、培养基及其他器材需高压蒸汽灭菌处理，避免污染环境，若没有高压蒸汽灭菌锅，不宜开展此实验。参考文献刘恩山，曹宝义.普通高中生物学课程标准(2017版)解读M.北京：高等教育出版社,2018.朱正威，赵占良.普通高中教科书：生物：必修2遗传与进化M.北京：人民教育出版社，2019.田双娥.三种不同抑菌圈试验法在牛至油抑菌评价中的应用研究几香料香精化妆品，2019,No.l：37-41.谭才邓，朱美娟，杜淑霞，等,抑菌试验中抑菌圈法的比较研究J.食品工业，2016,37(11)：122-125.
