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1、Bl5内蒙古自治区地方标准DB羊布鲁氏菌免疫抗体（M5-90426株）与感染抗体鉴别技术IdentificationtechnologyofBrucellaovisimmuneantibody（strainM5-9026）andinfectionantibody（征求意见稿）20XX-XX-XX 发布20XX-XX-XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出并归口。本文件起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙古金迈诗生物科技有限公司本文件起草人：郭宇、王建龙、陈君
2、彦、包玉山、特木尔巴根、萨茹拉、高登军、庄金山、王旭红、武琥琮、马立峰、郝剑锋、陈设。标准名称1范围本文件规定了羊布鲁氏菌免疫抗体（M5-90A26株）与感染抗体鉴别技术的术语和定义、缩略语、仪器设备、试剂、样品的采集、保存与运输、操作方法、结果判定的要求。本文件适用于羊布鲁氏菌免疫抗体（M5-90A26株）与感染抗体鉴别。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T18646-2018
3、动物布鲁氏菌病诊断技术NY/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1布鲁氏菌病BruceIIosis是由布鲁氏菌（Brucella）感染动物和人而引起的一种人兽共患传染病。目前已报道的布鲁氏菌属成员包括6个经典种、5个新鉴定种及部分未确定新种型的非典型布鲁氏菌。布鲁氏菌病在全世界范围内严重威胁动物和人类健康。世界动物卫生组织（WOrdOrganizationofAnimalHealth,WoAH）将布鲁氏菌病列为法定报告传染病，我国农业农村部发布的一、二、三类动物疫病病种名录将布鲁氏菌病列为二类动物疫病，国家卫生健康委员会将布鲁氏菌
4、病列为法定报告乙类传染病。3.2脂多糖Lip。POlySaCCharide,LPS作为布鲁氏菌细胞外模的重要组分，是布鲁氏菌主要病原相关分子模式之一，由寡聚糖核心两端分别连接疏水脂质A或。型多糖抗原组成。LPS作为布鲁氏菌表面最多的抗原结构，机体对其免疫应答产生的抗体是布鲁氏菌病各种诊断方法中的主要检测抗体。3.3膜间质蛋白PeriPlaSmiCProtein,BP26是一种可溶性的具有较强免疫原性的外膜蛋白，可由细胞内向细胞外释放。BP26蛋白的基因具有高度的保守性和免疫原性，是布鲁氏菌基因缺失活疫苗（15-90426株）的缺失基因。3.4酶联免疫吸附试验EnzymeLinkedImmuno
5、sorbentAssay,ELISA指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体反应的高度特异性与酶标记技术相结合，进行免疫反应的定性和定量检测方法。DB4缩略语下列缩略语适用于本文件。4. 1HRP辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase)；4.2 TMB3,3,5,5-四甲基联苯胺(Tetramcthylbenzidine)；4.3 PBS磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline)；4.4 OD光密度(OpticalDensity)o5主要器材4.5 酶标仪(含有45Onm滤光片)。4.6 (371)恒温培养箱。5. 3离心机。5.2
6、 4-20C冰箱。5.3 旋涡振荡器。5.4 可调微量移液器(量程为10100lx20-200lx30300l和1001000u1等)，并配备与移液器相匹配的吸头。5.5 96孔酶标板。5.6 血清稀释板。5.7 封板膜。6主要试剂6.1 除规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T6682-2008的规定。6.2 包被抗原按照附录A中A.1配制。6.3 抗原包被缓冲液按照附录A中A.2配制。6.4 PBS(0.01molL,PH值7.4)按照附录A中A.3配制。6.5 封闭液按照附录A中A.4配制。6.6 20倍浓缩洗涤液按照附录A中A.5配制。6.7 样品稀释液按照附录
7、A中A.6配制。6.8 阳性对照按照附录A中A.7配制。6.9 阴性对照按照附录A中A.8配制。6.10 酶结合物按照附录A中A.9配制。6.11 TMB显色液为商品化产品。6.12 终止液按照附录A中A.10配制。7样品采集、保存与运输7.1 样品采集按照NY/T541进行，室温(18-25oC)下倾斜30。静置24h,待血液凝固有血清析出时，置4冰箱过夜，待大部分血清析出即为待检血清，必要时可低速离心(IoOOrmin离心1015minmin)t收集血清。样品采集应符合GB19489-2008规定。7.2 样品保存置于-20C贮存备用，使用前2小时取出解冻，避免血清反复冻融。若分离的血清需
8、当天使用，则置于4。C备用。若需长期保存，应置于超低温冰箱(-70C)。7.3 样品运输样品应置于2C8C保存，立即送至实验室；如果保存超过12h后运输，样品应冷冻(-2(Te)保存。8操作方法8.1 试剂平衡试剂在室温(18-250C)条件下放置至少30分钟，平衡至室温(18-250C)后使用，使用前充分摇匀。8.2 试剂配制将20倍浓缩洗涤液用蒸储水或去离子水进行20倍稀释，即为工作浓度的洗涤液。8.3 样品稀释在血清稀释板中，用样品稀释液将待测样品10倍稀释(即90l样品稀释液中加入10l待测样品)，充分混匀，备用。8.4 抗原包被用包被缓冲液将纯化BP26蛋白稀释至0.5gml,将LP
9、S稀释至2gmlt按每孔100l加入不同96孔酶标板中，分别标记为LPS包被板和为26包被板,贴封板膜，置28作用1618小时。即，LPS包被板标记为“、L2,BP26包被板标记为Bl、B2o包被板上阴性对照、阳性对照和待检样品的分布，如下图1和图2所示。图1LPS包被板加样示意图LlL2L3L4L5L6L7L8L9LlOLllL12123456789101112ANBNCPDPESlFS2GS3HS4AN注P表示加阳性对照，表示加阴性对照，SlsS2、S3、S4和其余孑L表示加待检样品。图2BP26包被板加样示意图BlB2B3B4B5B6B7B8B9BlOBllB12123456789101
10、112ANBNCPDPESlFS2GS3HS4注P表示加阳性对照，N表示加阴T性对照，SlsS2、S3、S4和其余孔表示加待检样品。8.5洗涤弃去孔中液体，每孔加入300Hl工作浓度洗涤液，洗涤3次，在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。8.6 封闭每孔加入200In封闭液，贴封板膜，置37。C恒温培养箱内封闭孵育3小时。8.7 洗涤洗涤方法同8.5。8.8 加样8.8.1加阴阳性对照：在8.4已标记LPS包被板和BP26包被板，分别设阴性对照2孔、阳性对照2孔。即，在LPS包被板和BP26包被板的Al和BI孔中，分别加入阴性对照各100g；在Cl和DI孔中，分别加入阳性对
11、照各100口1。8.8.2加样：在8.4已标记LPS包被板和BP26包被板的剩余孔（除Al、Bl、CI和Dl孔）中，分别先加入80u1样品稀释液后，再加入步骤8.3中已稀释好的待检样品20uIo8.9孵育轻轻振匀孔中样品，盖上封板膜，置37C恒温培养箱内孵育30分钟（1分钟）。8.10洗涤洗涤方法同8.5。8.11加酶结合物每孔加入100。酶结合物，盖上封板膜。8.12孵育置37。C恒温培养箱内孵育1小时（1分钟）。洗涤方法同8.5。8.14显色每孔加入IOoPITMB显色液，盖上封板膜，置37C恒温培养箱内孵育15分钟（1分钟）。8.15终止每孔加入IOog终止液，终止显色反应。8.16测定
12、使用酶标仪测定450nm波长处样品和对照的吸光值（0D450nm）。9结果判定9.1 实验成立条件若PCLPS/NCLPS2.11且PCBP26/NCBP262.1时，则判为试验成立。否则，本次试验无效，需重新进行。注：PCLPS1表示LPS包被板上阳性对照的OD450nm平均值；NCLPS1表示LPS包被板上阴性对照的0D450nm平均值。PCBP26,表示BP26包被板上阳性对照的0D450nm平均值；NCBP26,表示BP26包被板上阴性对照的OD450nm平均值.9.2 S/N值的计算公式S/N值LPS=SLPS/NCLPS;S/N值BP26=SBP26/NCBP26o注：S/N值LP
13、S,表示样品在LPS包被板的S/N值；S值BP26,表示样品在BP26包被板的S/N值。SLPS1表示样品在LPS包被板上的0D450nm值；SBP26,表示样品在BP26包被板上的0D450nm值。9-3结果判定9.3.1若S/N值LPS3.1时，与S/N值BP26无关，则结果判定为阴性，表示没有免疫羊布鲁氏菌疫苗，同时也没有羊布鲁氏菌野毒株感染。9.3.2若S/N值LPS23.1且S/N值BP263.3,则结果判为LPS阳性，表示布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90A26株）免疫抗体阳性。9. 3.3若S/N值LPS23.1且S/N值BP2623.3,则结果判为LPS和BP26蛋白抗体阳性，
14、表示羊布鲁氏菌野毒株感染。附录A（规范性）相关试剂的配制A-1抗原的制备从灭活的羊种布鲁氏菌弱毒菌Rev.1株中提取核酸，应用PCR技术扩增编码BP26蛋白开放阅读框的753bp核甘酸序列，利用DNA无缝克隆技术，将其克隆至PCoIdIDNA载体中，诱导表达重组BP26蛋白。用蛋白纯化仪纯化重组BP26蛋白，BCA方法测定重组BP26蛋白的浓度达到0.5mgml01.PS的提取，参照GB/T18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术中附录G.3.IoA.2抗原包被缓冲液（0.05m。l/L的pH9.6碳酸盐缓冲液）称取2.93g碳酸氢钠、1.59g碳酸钠、0.2g叠氮钠，加入80Oml蒸僧水溶
15、解，调节PH至9.6,最后加蒸储水定容至IooOm1。121C,30min高压灭菌，置28保存备用。A.3PBS（0.01molL,PH值7.4）称取1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾、8g氯化钠和0.2g氯化钾，溶于80Oml蒸僧水中，用HCI调PH值至7.4,最后加蒸储水定容至IOoom1。121,30min高压灭菌，置28保存备用。A.4封闭液称取IOg明胶，加入80OmlPBS（0.OlmolL,PH值7.4）中，搅拌溶解，最后再加PBS定容至100Oln1。过滤除菌，置28保存备用。A.520倍浓缩洗涤液称取58g磷酸氢二钠（含12个结晶水）、4g磷酸二氢钾、160g氯化钠、
16、4g氯化钾，溶于80Oml蒸播水中，再加入IOml吐温-20,最后加蒸镭水定容至IOoOml（J1210Ct30min高压灭菌，置28保存备用。A.6样品稀释液称取50g脱脂奶粉、0.5mlTween-20,加入至800m】PBS（0.OlmolZL1PH值7.4）中,搅拌溶解，最后再加PBS定容至IOoOm1。过滤除菌，置28保存备用。A.7阳性对照商品化标准阳性血清，用样品稀释液（按A.6中方法配制）1:50稀释。置28保存备用。A.8阴性对照商品化标准阴性血清，用样品稀释液（按A.6中方法配制）1:50稀释C置28保存备用。A.9酶结合物将商品化HRP标记的驴抗山羊和H即标记的驴抗绵羊酶标抗体，按照1:1混合后，用样品稀释液（按A.6中方法配制）按1:5000稀释，搅拌均匀。置28保存备用。A.10终止液量取IlOnll98%浓硫酸，缓慢滴加到600ml蒸馈水中并不断搅拌，最后加蒸储水定容至100om1。置28C保存备用。
