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1、羊多杀性巴氏杆菌病诊断技术Diagnosistechnologyofpasteurellosismultocidainsheep点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX -XX-XX 实施XXXX-XX-XX发布内蒙古自治区市场监督管理局A/,一、刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会(SAM/TC19)归口。本文件主要起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古杜美牧业生物科技有限公司。本文件主要起草人：王娜、赵世华、戴伶俐、白帆、张月梅、
2、达来宝力格、刘学文、谢慧慧、张帆、杨斌、宋越、刘威羊多杀性巴氏杆菌病诊断技术1范围本文件规定了羊多杀性巴氏杆菌病的诊断技术。本文件所规定的临床诊断、病理解剖、病原分离鉴定，适用于羊多杀性巴氏杆菌病的诊断。定种PCR适用于多杀性巴氏杆菌的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法GB/T19915.2-2005猪链球菌2
3、型分离鉴定操作规程NY/T563-2002禽霍乱（禽巴氏杆菌病）诊断技术NY/T563-2016猪多杀性巴氏杆菌诊断技术3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1多杀性巴氏杆菌PaSteUrellamuItocida羊多杀性巴氏杆菌病又称羊出血性败血症，是由多杀性巴氏杆菌引起的一种以败血和肺炎为主要特征的细菌性传染病，是危害羊产业健康发展的主要疫病。多杀性巴氏杆菌为兼性厌氧革兰氏阴性短小杆菌，主要附着在家畜的呼吸道和消化道上，当家畜因环境等因素产生应激时，会被该菌入侵感染全身各组织器官。患病家畜伴有精神沉郁、咳嗽、流涎、泡沫样鼻涕、拉稀等临床表现。多杀性巴氏杆菌根据英膜抗原可分为A、Bs
4、D、E、F5种血清型，不同血清型与宿主和疾病之间有一定的相关性，国内主要流行A和D型，根据脂多糖抗原可分为16种血清型；根据是否产生多杀性巴氏杆菌毒素分为非产毒多杀性巴氏杆菌和产毒多杀性巴氏杆菌。4诊断技术根据典型症状和病变及触片镜检为革兰氏阴性小杆菌，初步诊断为本病，确诊该病仍需进行病原菌的分离鉴定。3.1.1 症状4. 1.1.1急性型症状急性型病羊精神沉郁，停止采食，体温升高，口鼻有带血黏液流出，呼吸急速，咳嗽增多，先发生便秘，后变为腹泻或者二者交替发生，最终机体脱水、衰竭，死亡，病程可持续25天左右。5. 1.1.2慢性型症状慢性型通常是成年羊发生，病程可持续超过3周，病羊表现出被毛粗
5、乱，厌食，消瘦，颈部和胸腹部出现水肿。个别病羊的角膜发炎和出现程度不同的腹泻，如果出现严重的继发感染也会造成死亡。4.1.2病理变化急性型下颌淋巴结发生水肿、出血，心包积液，心包膜上存在纤维素絮片，胸腔内含有大量浆液性纤维素性渗出液，气管内存在很多混杂泡沫的淡红色液体，肺脏发生淤血、出血，间质变宽，切面有大量的浆液，组织中存在不同大小的坏死灶，肺门淋巴结发生肿胀、出血。5病原分离鉴定5.1方法概要检验程序的流程示意图见附录A（资料性附录）。5.2 试剂和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的蒸储水。各种培养基的制备方法见附录B（规范性附录）。5.3 仪器和设备
6、5.3.1匀质器和匀质杯。5.3.2天平：称量范围Og-1OOOg,读数精度0.0001g5.3.3培养箱：37C05.3.4恒温水浴锅。5.4.1样品采集对病死羊主要采集其气管和肺脏等组织；对活羊可采取鼻腔拭子。5.4.2分离培养5.4.2.1送检菌株的分离划线接种于含5%马血清的胰蛋白月东大豆琼脂平板(TSA),37C培养16h20h,使之形成单个菌落，以供鉴定用。5.4.2.2病料的分离和触片检查用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)或普通琼脂绵羊血平板(见第B.2章)，于37培养16h20h后观察。同时取病料做组织触片，革兰氏染
7、色(按GB/T4789.28的方法进行染色)后镜检，如见粉红色小杆菌则表明病料中可能含有多杀性巴氏杆菌。5.4.2.3鼻腔拭子的分离鼻腔拭子样品加入到含有5ml,灭菌的含5%马血清胰蛋白陈大豆肉汤(TSB)(见第B.3章)的试管中，于37C培养16h20h后，划线接种于普通琼脂绵羊血平板或5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)(见第B.1章)。5.4.2.4动物产品的均质、增菌和分离以无菌操作取检样25g,加入装有225ml灭菌的含5%马血清胰蛋白陈大豆肉汤(TSB)(见第B.3章)的广口瓶内，均质，于37C培养12h16h后划线接种于5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)或普通琼脂绵
8、羊血平板(见第B.2章)。5.4.3初步鉴定羊多杀性巴氏杆菌在37培养18h后，在普通琼脂绵羊血平板和含5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)上形成圆形微凸起、表面光滑、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3mm-1.2mm,菌株Y溶血。将可疑菌落做革兰氏染色，本菌为革兰氏阴性杆菌，菌体直径约1uni,固体和液体培养物均以单个菌为多，无芽胞，能形成荚膜(按GB/T4789.28的方法进行染色)。菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和普通琼脂绵羊血平板Y溶血及麦康凯培养基平板单个菌落呈红色符合者，可初步确定为羊多杀性巴氏杆菌。5.4.4生化鉴定经初步鉴定后，细菌在37培养18h后，生化试验结果显
9、示分离菌氧化酶、鸟氨酸脱竣酶、木糖、海藻糖、甘露醇、回睬、葡萄糖、触酶阳性，服酶、乳酶、甲基红、氧化酶、VP阴性。此生化结果符合多杀性巴氏杆菌的特点。5.4.5多杀性巴氏杆菌特异性PCR检测取12个纯培养物的单菌落加入100ML无菌超纯水中，混匀，沸水浴Ionlir1,冰浴5min,12000r离心1min,上清作为基因扩增模板，同时设置阴阳性对照。将提取的DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：DNA聚合酶12.5L,无菌去离子水10.5ML1上、下游引物各05ML,DNA模板1L0混匀后，在PCR仪上执行如下操作：95C4min；9430s,5630s,721min,30个循环；72C延
10、伸7min0PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。若不立即电泳将PCR产物置于-20C保存。6试验结果分析判定6.1 符合以下特性者应判为多杀性巴氏杆菌一多杀性巴氏杆菌在37C培养16h后，在普通琼脂绵羊血平板和5%马血清的TSA培养基平板上形成圆形微凸起、表面光滑、边缘整齐、半透明的菌落，直径约03mm1.2mm,菌株呈Y溶血；麦康凯培养基平板上不生长。- 革兰氏阴性杆菌，大多数单个存在；一葡萄糖酸盐试验阴性；- 发酵葡萄糖、蔗糖等糖类，发酵甘露醇，不发酵乳糖、麦芽糖、木糖，口引口朵、硫化氢、氧化酶试验阳性。- 多杀性巴氏杆菌通用基因及荚膜血清型特异基因PCR检测阳性。6.2 符合以下特
11、性者的菌株可判定为多杀性巴氏杆菌一符合5.1的特性；一通用基因及荚膜血清型特异基因PCR检测阳性。7废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。附录A（资料性）多杀性巴氏杆菌检测待检菌株待检组织鼻拭子动物产品、/、，7抹片镜检5%马血清+TSB培养基富集普通琼脂绵羊血平板5%马血清+TSB培养基大多数菌体为G-小杆菌鉴定为多杀性巴氏杆菌生化鉴定：发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇；呵躲、硫化氢、氧化酶试验阳性。附录B(规范性)各种培养基的配制方法普通琼脂绵羊血平板牛肉膏蛋白陈抓化钠(NaCI)磷酸二氢钾(KH2P04)琼脂蒸播水脱纤维无菌绵羊血3.Og10.Og5.Og1.0g1
12、5.Og1OOOmL50mL除无菌绵羊血外，混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，115C灭菌15min,冷却至45C加入5%无菌脱纤维绵羊血倾注灭菌平板B-2胰蛋白月东大豆琼脂培养基(TSA)配方:(gL)胰酪蛋白陈大豆蛋白陈氯化钠琼脂纯化水15g5g5g15g100Oml取上述成分除琼脂，混合，微热溶解,调节PH值使灭菌后在25的PH为7.30.2,加入琼脂，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约60C,在无菌操作要求下倾注约20ml,至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固C平皿培养及保存:制备好的培养基平皿宜在2-8C保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜方法在平皿上做好培养基的名称、
13、制备日期记录的标记。B3胰蛋白陈大豆肉汤(TSB)配方:(gL)胰酪蛋白月东大豆蛋白陈D-葡萄糖氯化钠磷酸氢二钾PH17g3g2.5g5.0g2.5g7.3+/-0.2用IOoOnlI去离子水溶解30g培养基粉末。调节PH至7.3。TSB培养基灭菌条件是，12IC高压蒸汽灭菌15minoB.4麦康凯培养基平板配方:(gL)蛋白陈乳糖20.Og10.Og牛胆盐氯化钠中性红琼脂PH值将上述成分,5.Og5.Og0.03g14.Og7.l0.2加热溶解于100Oml蒸镭水中，121高压灭菌15分钟备用。附录C（资料性）多杀性巴氏杆菌PCR扩增引物序列C1多杀性巴氏杆菌PCR扩增引物序列表1多杀性巴氏
14、杆菌PCR扩增引物序列基因型基因引物名称序列(Sfa)目的片段bpAllKMTlKMTl-FKMTlRAtccgctatttacccagtggGctgtaaacgaactcgccac460AhyaD-hyaChyaD-FhyaD-RTgccaaaatcgcagtcagTtgccatcattgtcagtg1044BbcbDbcbD-FbcbD-RCatttatccaagctccaccGcccgagagtttcaatcc760DdcbFdcbF-FdcbF-RTacaaaagaaagactaggagcccCatctacccactcaaccatatcag657EecbjecbJ-FecbJ-RTccgcagaaaattattgactcGcttgctgcttgattttgtc511FfcbDFcbD-FFcbD-RAatcggagaacgcagaaatcagTtccgccgtcaattactctg811
