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1、耐高温a-淀粉酶发酵条件优化实验方案设计综述:耐高温a-淀粉酶通常采用地衣芽抱杆菌经深层培养、提取等工序精制而成,能随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的a-L4葡萄糖昔健。使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降,变成液化淀粉并裂解产生可溶性糊精和寡聚糖,过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。其液体产品外观呈棕褐色液体,易溶于水,密度为1.15-1.25gmlo耐高温a-淀粉酶稳定的PH范围为5.(H0.0,有效的PH范围为5.08.Oo最适PH范围为5.57.0,最佳PH范围为6.06.2,在淀粉糖化和味精行业生产中均采用的PH范围为6.06.2。耐高温淀粉酶在90-95。C范围内非常稳定，淀粉进行喷射液
2、化迅速快捷、完全彻底。在喷射液化工艺中瞬间温度达105-110,仍能有效水解淀粉。耐高温a-淀粉酶制剂为有机生化物质,在较低浓度的钙离子存在的情况下有很好的稳定性。对于淀粉的水解,推荐加入50-100PPnl钙离子,因此常采用添加自来水的方法提供钙源。日光、温度、湿度易引起酶失活,铜、钛、钻等金属离子对本品也有一定影响,铅、铝、锌等金属离子对该试剂有较强的抑制作用。耐高温a-淀粉酶具有极好的耐热性,能广泛应用于淀粉、酒精、啤酒、味精、酿造、纺织退浆等工业上。近年来随着双酶法制糖工艺在粮食深加工领域的成功应用，该工艺给发酵工业诸如啤酒工业、酒精工业、味精工业、酵母工业、柠檬酸工业、抗菌素工业等带
3、来的巨大的经济效益。这也使得耐高温a-淀粉酶作为一种新型酶制剂得到广泛的应用，且有着良好的发展前景。目前一般企业生产的酶制剂耐高温Q-淀粉酶酶活在40000uml左右，完全可以满足实际生产中淀粉液化的要求。但是传统在采用地衣芽加杆菌、米曲霉深层培养发酵得到发酵液中酶活较低,酶活最高仅达到7500ulo采用转基因毕赤氏酵母工程菌生产可以提高发酵液中酶活达到25000umlo毕赤氏酵母表达系统是目前最优秀应用最广泛的外源基因表达系统之一,它操作简单、表达量高,有着大肠杆菌表达系统和其它酵母表达系统无法比拟的优越之处。为寻求适于工业生产的耐高温-淀粉酶产生菌及其发酵条件,有必要经过一系列的技术方法改
4、造获得真正意义的用于工业生产的高产菌株生物技术便是手段之一。本实验利用山东大学提供的转地衣芽抱杆菌耐高温-淀粉前基因的重组毕赤酵母基因工程菌。通过优化发酵条件来提高酶产量和酶活性,降低生产成本，为工业化发酵生产奠定基础。实验方案设计一、实验目的：1通过优化培养条件提高耐高温a-淀粉酶在基因工程菌中的表达,分泌。现阶段在推荐的培养条件下采用本菌种进行摇瓶发酵实验,测得酶活为5.8-48uml0通过不断优化培养条件,使酶活目标达到100-200umL2通过优化分离提取方法提高酶产量和酶活力。3进行初步的扩大培养,为工业化发酵生产提供参考。二、实验原理：毕赤氏酵母不仅能以甲醇作为唯一能源和碳源，而且
5、在甲醇培养基中生长异常迅速，可进行高密度连续培养，当毕赤氏酵母从非诱导的葡萄糖培养基或甘油培养基转移到诱导型的甲醇培养基上时，会大量合成甲醇氧化酶，并在微体中以晶体(非溶蛋白)形式积聚。这一特点对外源蛋白融合表达十分有利，可使它们免受蛋白酶降解且对宿主细胞不产生毒害作用。典型的转基因毕赤氏酵母工程菌表达载体内含有醇氧化酶基因的调控序列(5AOXl启动子、3,AOXl终止序列、3AOXl序列)，其中含多克隆位点(MCS)供外源基因插入。以巴斯德毕赤氏酵母组氨醇脱氢酶基因(HIS4)作为互补性筛选标志,一般在载体中还包含有某个抗生素抗性基因如AmpR.KanR等。为了更有利于外源蛋白生产的下游加工
6、，构建了毕赤氏酵母的分泌型表达载体。它是在一般胞内融合表达载体的基础上增加了一个分泌信号序列，位于5AOXl与MCS之间。在这个分泌信号的引导下，导入外源基因的毕赤氏酵母可以以甲醇作为唯一碳源，进行快速繁殖生长。当培养基中的葡萄糖浓度低至0.lgml时,毕赤氏酵母会启用甲醇作为能量。此时AoX基因被激活,AOX所在的质粒得到翻译表达,菌体开始产生并分泌耐高温Q-淀粉酶。三、实验器材及试剂：菌种:转基因毕赤氏酵母菌试剂:糖蜜PTMl甲醇磷酸缓冲液(PH6.0)尿素甘油硫酸钾七水合硫酸镁盐酸稀碘液等仪器:分光光度计,恒温水浴锅,高压蒸汽灭菌锅,摇床,无菌超净工作台，冰箱,离心机,纱布等四、实验流程
7、(1)目的菌株的选取:本实验采用山东大学提供的Fl的转基因毕赤氏酵母菌,从地衣芽泡杆菌基因库中分离得到转录翻译成耐高温。-淀粉酶的目的基因,通过重组DNA技术将此目的基因通过重组质粒的形式转移到毕赤氏酵母体内得到的转基因工程菌株。然后在抗生素培养基上进行选择性培养,只有转录进外源基因的毕赤氏酵母才能存活并生长。经过一段时间培养后,从该培养基上挑取单菌落移至斜面培养。(2)斜面培养:在无菌条件下将目的菌株转接到琼脂固体斜面培养基上进行扩培,并放置在冰箱内，作为摇瓶实验接种备用。以后每两个月转接一次,防止菌株老化。(3)摇瓶初步培养培养基制备(gL):1糖蜜:按培养基含糖量5%计算,原糖蜜含糖50
8、%2 PTMl:4.0mlL三角瓶中单独灭菌,接种时一起添加3 甲醇：10%的甲醇75ml100ml125ml4 IInOl/L磷酸缓冲液(PH6.0):100ml5尿素10gL6甘油10gL培养基灭菌根据甲醇添加量的不同分75ml,100ml,125ml三组,每组制备三个平行样,分别加入到九个三角瓶中并标记。用四层纱布包扎瓶口，然后用无菌报纸包扎,在高压灭菌锅中灭菌30mino接种打开无菌超净工作台的紫外灯灭菌30min,等培养基完全冷却后,在无菌操作条件下加入单独灭菌的营养成分,并依次进行接种。摇瓶培养将接种好的三角瓶放置在摇床上,分三个梯度,每个梯度三个平行共九个摇瓶在30、220rmi
9、n的条件下分别培养48h,72h,96h后取样。待测酶液的制备将取样的发酵液进行在8000rmin的转速下进行离心处理15min,取上清液用四层纱布过滤于试管中待用。酶活力测定1吸取20ml可溶性淀粉溶液于试管中,加入磷酸缓冲液5,摇匀后置于70C0.2恒温水浴中预热8min2加入1.OOml离心过滤后的发酵液,立即计时,摇匀，准确反应5min03立即吸取1.OOml反应液,加到预先盛有0.5ml稀盐酸和5.OOml稀碘液的试管中摇匀，并以0.5ml稀盐酸和5.OOml稀碘液为空白，于660nm波长下,用IOmm比色皿迅速测定其吸光度。根据吸光度与酶浓度关系的表中数据,求得发酵液中酶的浓度。酶
10、活计算X=cXnX16.67X:样品的酶活力c:测试酶样的浓度n:样品的稀释倍数改进培养条件后进行平行试验A改进培养基成分(gL):1糖蜜:按培养基含糖量5%计算,原糖蜜含糖50%2PTM1:4.0mlL三角瓶中单独灭菌,接种时一起添加3甲醇：10%的甲醇75ml100ml125ml4ImoI/L磷酸缓冲液(PH6.0):100ml5尿素10gL6硫酸钾18.2gL7七水合硫酸镁14.9g/LB改变PTMl,磷酸的灭菌添加时间采取混合添加,共同灭菌的方法进行平行试验C改变发酵的取样时间,确定最高酶产量的培养时间(4)发酵罐发酵:进行摇瓶实验的放大培养备注：由于本实验过于繁杂,因此只取摇瓶培养阶
11、段作为实验方案设计。本实验(4)及以下标题中内容目前还没有进行,所以在实验方案中并没有详细描述,仅列提纲。五、目的产物分离纯化:分离纯化后目标酶活应达到2000025000uml0六、指标分析及预期结果分析：目前摇瓶实验阶段测得酶活仅50u/ml左右,通过优化培养条件,需要达到170u/ml左右才能获得理想的实验结果。七、实验注意事项：1试剂的制备保存应严格按照规定的方法。2应严格控制加热温度和加热时间。3分光光度计和恒温水浴锅要提前预热,读书稳定后在进行测定。八、结果与讨论：1钙离子浓度对发酵影响较大,太低容易造成酶活力减弱,适应的作用PH范围减小。太高易造成酶结构不稳定。是否添加还是采用自来水不确定？2由于发酵液颜色太深,导致与淀粉反应后颜色依旧残留。测吸光度时与参比对比太大,现阶段采取向参比溶液中加发酵液的方法。是否应该替换培养基中的糖蜜？3同样的酶量反应时间不同,结果差异很明显,是否应该延长标准反应时间？4如何避免产生菌球？5甲醇的诱导机制,浓度太高细胞有毒性,太低起不到诱导作用。以及前期抑制生长作用。此转基因酶的产生机制：以甲醇作为唯一碳源后产生？甲醇开启转入基因的转录?而且甲醇是有毒的,作为食品添加剂后期有无去除必要。6毕赤氏酵母表达的酶量很高,但是分泌的量只占总量的60%左右,如何充分利用胞内产物。7需要考虑酵母或杂菌产生的蛋白酶对产物的降解作用。
